طريقه خاليه من الانزيمات للعزل والتمدد للخلايا الجذعية الدهنية المستمدة من الدهون البشرية
Summary
يوفر هذا البروتوكول طريقه خاليه من الانزيمات لعزل الخلايا الجذعية المسمارية من البطن والعينات الشحمية باستخدام طريقه الشرح. عدم وجود الانزيمات القاسية أو الخطوات طرد يوفر للخلايا الجذعية ذات الصلة سريريا التي يمكن استخدامها للدراسات في المختبر أو نقلها مره أخرى إلى العيادة.
Abstract
الخلايا الجذعية المسمارية (MSCs) هي مجموعه من الخلايا المتعددة القوية التي يمكن عزلها عن مختلف الانسجه البالغة والجنينية ، بما في ذلك الانسجه الدهنية. كنوع الخلية ذات الصلة سريريا ، هناك حاجه إلى الطرق المثلي لعزل وتوسيع هذه الخلايا في المختبر. معظم الطرق لعزل MSCs المستمدة من الدهنية (ADSCs) تعتمد علي الانزيمات القاسية ، مثل كولاجيناز ، لهضم الانسجه الدهنية. ومع ذلك ، في حين فعاله في تحطيم الانسجه الدهنية والغلة الانتعاش ADSC عاليه ، وهذه الانزيمات مكلفه ويمكن ان يكون لها تاثير ضار علي Adsc-بما في ذلك مخاطر استخدام مكونات xenoجينه في التطبيقات السريرية. هذا البروتوكول تفاصيل طريقه لعزل ADSCs من الدهون الطازجة وعينات شد البطن دون الانزيمات. وباختصار ، تعتمد هذه الطريقة علي التفكك الميكانيكي لأي نسيج سائب يتبعه نظام ثقافي من نوع الشرح. يسمح لل ADSCs للهجرة من الانسجه وعلي لوحه ثقافة الانسجه ، وبعد ذلك ADSCs يمكن ان تكون مثقفه وتوسيعها في المختبر لأي عدد من البحوث و/أو التطبيقات السريرية.
Introduction
الخلايا الجذعية المستوية (MSCs) هي فئة من الخلايا الجذعية البالغة القوية التي يمكن عزلها عن مختلف الانسجه البالغة والجنينية ، بما في ذلك من الانسجه الدهنية. هذه الخلايا هي نوع خليه جذابة لكل من البحوث الاساسيه والتطبيقات السريرية بسبب اللدونة الخاصة بهم للتمييز في خلايا جميع الطبقات الجرثومية في المختبر ، عبر الحواجز الخيفيه ، موطن لمناطق التهاب ، وقمع التهاب (مراجعه في شيرمان ، وآخرون.1). الدهنية المشتقة MSCs (ASCs) جذابة بشكل خاص نظرا لسهوله حصول علي ، كما يعتبر الانسجه الدهنية عموما الانسجه المرتجعة بعد شفط الدهون الروتينية وإجراءات شد البطن. ومع ذلك ، وبمجرد الحصول عليها ، وتخضع العينات عموما لظروف قاسيه – اما الانزيميه أو طرد — من أجل عزل ascs2,3. يوضح هذا الأسلوب اجراء بسيط لعزل ASCs باستخدام طريقه شرح ، في غياب الانزيميه القاسية أو الخطوات طرد.
الطريقة الأكثر شيوعا لعزل ASCs يتكون من غسل عينه الدهنية ، انزيمي هضم العينة مع كولاجيناز ، يطرد العينة ، وأخيرا ليسينج خلايا الدم الحمراء قبل ان الخياطة ASCs4. في حين كفاءه في عزل الغلة عاليه من ascs ، واستخدام مكونات xenoجينه (علي سبيل المثال ، الهضم الانزيمي مع كولاجيناز) يعتبر أكثر من “الحد الأدنى من التلاعب” من قبل الولايات الامريكيه الغذاء والدواء ، ويمكن ان تشكل مخاطر مثل رد فعل المناعي ، ومنع استخدام الخلايا في العيادة5،6. للتقليل من مخاطر المكونات الغريبة ، اقترحت العديد من المجموعات غير الحيوانية المشتقة ، والانزيمات المصنعة لهضم الانسجه الدهنية. ومع ذلك ، هذه الانزيمات لا تزال قاسيه ، ويمكن ان يغير النمط الظاهري الخلية7.
وتشمل الطرق الأخرى لعزل ASCs طرد عاليه السرعة ، وذلك باستخدام قوات عاليه مثل 1,200 x g، و vortexing لعزل ascs8. حتى القوات منخفضه مثل 400 x g كانت كافيه في عزل ascs القابلة للاستمرار9. في حين ان هذه الخلايا تنتج كميه كبيره من الخلايا القابلة للحياة ، فشلت العديد من البروتوكولات في التكاثر بعد 14 يوما8. وعلاوة علي ذلك ، العزلة الميكانيكية غله عدد اقل من الخلايا المستعادة من الهضم الانزيمي ، ولكن نسبه اعلي من الخلايا المعزولة كانت ASCs بالمقارنة مع الخلايا الأخرى الذاتية للانسجه الدهنية في الممر 010.
عزل الأنقى ، والسكان أكثر قابليه للحياة من ASCs في وقت اقل ، إلى جانب تكلفه ومخاطر المكونات xenoجينه ، يجعل الهضم الانزيميه اقل واقل جاذبيه للترجمة إلى العيادة. في حين ان العزلة الميكانيكية هي في البداية نهج إيجابي ، هناك تفاوت كبير في الأساليب المستخدمة ، وحجم الانسجه المعالجة يقتصر علي حجم وحدات الطرد المركزي المتخصصة ، ويمكن ان تعتمد علي الاتساق المشغل2.
في حين ان كلا من الهضم الانزيمي والطرد بسرعة الغلة كميه كبيره من ASCs, هذه الخلايا المعزولة تظهر التغيرات الظاهرية, الرضوخ الاسئله حول سلوكهم عندما عاد إلى المريض2. التالي فان الأسلوب القائم علي الشرح للعزل ASC ، كما هو موصوف في هذا البروتوكول ، يستخدم من قبل بعض المجموعات ، حيث تهاجر الخلايا الدهنية من قطع صغيره من الانسجه الشحمية الصلبة3،11،12. هذه الهجرة من المحتمل ان يكون تاثير الخلايا التي يتم سحبها إلى وسائل الاعلام الغنية بالمغذيات. مثل السكان الآخرين من MSCs, ASCs التمسك البلاستيك, والبقاء علي قيد الحياة وتتكاثر في وسائل الاعلام الانسجه المستخدمة الثقافة (المكونات أدناه), السماح عزلتهم من أنواع الخلايا الأخرى من الانسجه الدهنية. في حين يتم استرداد عدد اقل من الخلايا في البداية — غالبا ما تستغرق > أسبوع واحد حتى تظهر الخلايا علي لوحه ثقافة الانسجه — فان هذه الاقراص غير المعالجة ستتكاثر في المختبر ، مما يسمح بتوسيع الخلايا للمجلدات ذات الصلة السريرية11،12،13.
Protocol
Representative Results
Discussion
ASCs هي مصدر جذاب من MSCs نظرا لسهوله الوصول إلى الانسجه. النسبة للتطبيقات السريرية والبحثية علي حد سواء ، يجب علي العلماء ان يضعوا في اعتبارهم تباين المانحين عند عزل هذه الخلايا وزراعتها. ولأسباب لم يتم توضيحها بعد ، تظهر MSCs من مختلف الجهات المانحة قدرات مختلفه للانتشار في المختبر ، والتي ستؤثر لاحقا علي هجره الشركة من القدرة علي التكاثر والانتشار الدهني. في حين يمكن ملاحظه تقلب في الوقت الذي يستغرقه لل ASCs معزولة من هذه التفسيرات خاليه من الانزيمات للوصول إلى كونفلوينسي, كان من النادر بالنسبة للعينه لا تتكاثر في المختبر.
والي جانب تقلبات الجهات المانحة ، فان المصدر الأكثر احتمالا لفشل الخلايا في الهجرة من الانسجه و/أو التكاثر في المختبر هو طول الوقت الذي تم فيه تخزين النسيج قبل المعالجة. وعندما سمح للعينات بالجلوس لمده > 12 ساعة قبل التجهيز أو لم يتم الاحتفاظ بها رطبه بين الحصاد والتجهيز ، لوحظت معدلات هجره وانتشار أكثر فقرا. العينات الوحيدة التي كثيرا ما فشلت في التكاثر هي عينات شد البطن التي لم تكن رطبه مع محلول ملحي: في هذه الحالات ، كان النسيج في مركز كتله الانسجه في كثير من الأحيان رطبه بما يكفي لمعالجه ، ولكن في بعض الأحيان تحتاج إلى التخلص منها. التالي فمن المهم للحفاظ علي الانسجه رطبه من وقت الحصاد من خلال تجهيز.
في الحالات التي لا يلاحظ فيها ASCs علي لوحه في 1 علامة الأسبوع ، يجب أزاله المواد التوضيحية الدهنية لا يزال من لوحات ثقافة الانسجه لئلا يحدث نخر الانسجه. في بعض الأحيان هناك عدد قليل جدا من الخلايا لتحديد بسهوله ، ولكن تلك الخلايا القليلة ستكون قادره علي التوسع داخل نظام الثقافة. إذا كانت الخلايا لا تزال لا تلاحظ في 3 أسابيع ، يجب ان تعتبر العزلة فشل.
في بعض الحالات ، وخاصه من شد البطن ، فانه ليس من الممكن الحصول علي عينه معقمه حقا بسبب القيود داخل الساحة الجراحية. إذا لم يكن من الممكن استخدام سفينة معقمه لنقل الانسجه من غرفه العمليات إلى غطاء التيار الصفحي ، وأزاله الخارجي 1 سم من الانسجه عموما كافيه لمنع تلوث الكائنات الحية المجهرية. إذا تم إرفاق عينه شد البطن بالجلد ، يمكن مسح الجلد باستخدام الايثانول 70% لتعقيم ذلك السطح قبل فرم الانسجه الدهنية.
اثناء عمليه الفرم ، من المهم ان يكون النسيج مفروما في قطع صغيره ودقيقه. إذا كان الشرح كبيرا جدا ، سيكون هناك مساحة سطح غير كافيه ل ASCs للهجرة من الانسجه وعلي لوحه. وعلاوة علي ذلك ، فمن الاهميه بمكان ان الانسجه لا تبقي في لوحه اي أطول من اللازم خشيه ان تصبح الانسجه نخريه.
الحد من هذه الطريقة هو استخدام انزيم (في البروتوكول الموصوف ، التريبسين) لفصل الخلايا الشحمية اثناء عمليه استزراع الانسجه. الانزيمات الأخرى غير الحيوانية المشتقة ، مثل Accutase ، يمكن استبدالها لأزاله الحاجة للمنتجات الحيوانية المشتقة ، ومع ذلك ، فان هذا سيزيد من تكلفه ثقافة الانسجه. لهذا السبب ، من بين أمور أخرى ، تقوم العديد من المجموعات بالتحقيق في أساليب زراعه الانسجه غير الثنائية الابعاد مثل المفاعلات الحيوية والنظم القائمة علي السقالات لزيادة إمكانات نمو MSC مع تقليل الحاجة إلى فصل الخلايا عن الركيزة22.
عند نقل ASCs إلى العيادة ، والحد الرئيسي من طريقه العزلة الشرح هو الاعتماد علي ممارسه التصنيع الجيدة (GMP) مستوي الانسجه ثقافة المرفق ، التي تفتقر إلى العديد من المراكز الطبية. وفي هذه الحالات ، سيلزم استخدام اي من الأساليب المتاحة تجاريا القائمة علي الانزيمات أو الطرد الذاتي. ومع ذلك ، وبما ان مرافق GMP أصبحت أكثر انتشارا ، فمن المتوقع ان يكون هذا التاثير محدودا. في هذه الاثناء ، حتى مثل هذه المرافق التي تفتقر إلى مرافق الزراعة الانسجه GMP يمكن النظر في استخدام طريقه الشرح لدراسة ASCs في المختبر: واقل التلاعب ، وأكثر أقرب هذه الخلايا هي لنظراءهم في الجسم المجري11.
توفر هذه الطريقة طريقه بسيطه لعزل الانسجه الدهنية من النسيج الشحمي — الشفط الشحمي والبطني — في غياب الانزيمات القاسية أو الخطوات الطردة. وفي حين ان الغلة الاوليه لهذه المراكز اقل من الطرق الأخرى ، فانها ستتكاثر في المختبر ، مما يقلل من تاثير الغلة الاوليه المنخفضة. وعدم وجود تلاعب مفرط أو قوي يجعل المراكز المذكورة معزولة بهذه الطريقة ذات الاهميه الخاصة ، حيث ان هناك عددا اقل من الاسئله (اي ما إذا كانت الآثار المرصودة ترجع إلى الخلايا نفسها أو إلى تلاعب الخلايا اثناء عمليه العزل ).
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ولا يوجد لدي المؤلفين اعترافات
Materials
| Dimethyl Sulfoxide | Fisher Bioreagents | BP231 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium – high glucose | Sigma-Aldrich | D5671 | |
| Falcon 3003 tissue culture plates | Corning | Corning | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F2442 | serum is batch tested to ensure it supports MSC growth |
| L-Glutamine solution | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| Mr. Frosty | Nalgene | 5100-0001 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma-Aldrich | T4049 |
References
- Sherman, L. S., Shaker, M., Mariotti, V., Rameshwar, P. Mesenchymal stromal/stem cells in drug therapy: New perspective. Cytotherapy. 19 (1), 19-27 (2017).
- Conde-Green, A., et al. Shift toward Mechanical Isolation of Adipose-derived Stromal Vascular Fraction: Review of Upcoming Techniques. Plastic and Reconstructive Surgery – Global Open. 4 (9), 1017 (2016).
- Hendijani, F. Explant culture: An advantageous method for isolation of mesenchymal stem cells from human tissues. Cell Proliferation. 50 (2), (2017).
- Zuk, P. A., et al. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Engineering. 7 (2), 211-228 (2001).
- Chang, H., et al. Safety of adipose-derived stem cells and collagenase in fat tissue preparation. Aesthetic Plastic Surgery. 37 (4), 802-808 (2013).
- Spees, J. L., et al. Internalized antigens must be removed to prepare hypoimmunogenic mesenchymal stem cells for cell and gene therapy. Molecular Therapy. 9 (5), 747-756 (2004).
- Tsuji, K., et al. Effects of Different Cell-Detaching Methods on the Viability and Cell Surface Antigen Expression of Synovial Mesenchymal Stem Cells. Cell Transplantation. 26 (6), 1089-1102 (2017).
- Markarian, C. F., et al. Isolation of adipose-derived stem cells: a comparison among different methods. Biotechnology Letters. 36 (4), 693-702 (2014).
- Palumbo, P., et al. In vitro evaluation of different methods of handling human liposuction aspirate and their effect on adipocytes and adipose derived stem cells. Journal of Cellular Physiology. 230 (8), 1974-1981 (2015).
- Shah, F. S., Wu, X., Dietrich, M., Rood, J., Gimble, J. M. A non-enzymatic method for isolating human adipose tissue-derived stromal stem cells. Cytotherapy. 15 (8), 979-985 (2013).
- Sherman, L. S., Conde-Green, A., Kotamarti, V. S., Lee, E. S., Rameshwar, P. Enzyme-Free Isolation of Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cells. Methods in Molecular Biology. 1842, 203-206 (2018).
- Raposio, E., Caruana, G., Bonomini, S., Libondi, G. A novel and effective strategy for the isolation of adipose-derived stem cells: minimally manipulated adipose-derived stem cells for more rapid and safe stem cell therapy. Plast and Reconstructive Surgery. 133 (6), 1406-1409 (2014).
- Sherman, L. S., Conde-Green, A., Sandiford, O. A., Rameshwar, P. A discussion on adult mesenchymal stem cells for drug delivery: pros and cons. Therapeutic Delivery. 6 (12), 1335-1346 (2015).
- Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. Flow cytometry protocols for surface and intracellular antigen analyses of neural cell types. Journal of Visualized Experiments. (94), 52241 (2014).
- Barlow, S., et al. Comparison of human placenta- and bone marrow-derived multipotent mesenchymal stem cells. Stem Cells and Development. 17 (6), 1095-1107 (2008).
- Munoz, J. L., et al. Feline bone marrow-derived mesenchymal stromal cells (MSCs) show similar phenotype and functions with regards to neuronal differentiation as human MSCs. Differentiation. 84 (2), 214-222 (2012).
- Amati, E., et al. Generation of mesenchymal stromal cells from cord blood: evaluation of in vitro quality parameters prior to clinical use. Stem Cell Research and Therapy. 8 (1), 14 (2017).
- Bajek, A., et al. Does the liposuction method influence the phenotypic characteristic of human adipose-derived stem cells. Bioscience Reports. 35 (3), (2015).
- Palumbo, P., et al. Methods of Isolation, Characterization and Expansion of Human Adipose-Derived Stem Cells (ASCs): An Overview. International Journal of Molecular Sciences. 19 (7), (2018).
- Bourin, P., et al. Stromal cells from the adipose tissue-derived stromal vascular fraction and culture expanded adipose tissue-derived stromal/stem cells: a joint statement of the International Federation for Adipose Therapeutics and Science (IFATS) and the International Society for Cellular Therapy (ISCT). Cytotherapy. 15 (6), 641-648 (2013).
- Ghorbani, A., Jalali, S. A., Varedi, M. Isolation of adipose tissue mesenchymal stem cells without tissue destruction: a non-enzymatic method. Tissue and Cell. 46 (1), 54-58 (2014).
- Bunpetch, V., Wu, H., Zhang, S., Ouyang, H. From “Bench to Bedside”: Current Advancement on Large-Scale Production of Mesenchymal Stem Cells. Stem Cells and Development. 26 (22), 1662-1673 (2017).
