Anticorpli uccisione test per valutare le risposte immunologiche contro batteri patogeni
Summary
Questo test di uccisione anticorpli viene utilizzato per confrontare la capacità delle cellule fagocitiche immuni di rispondere e uccidere i batteri basati su diversi trattamenti e/o condizioni. Classicamente, questo test serve come il gold standard per valutare le funzioni effettrici degli anticorpi alzati contro un batterio come opsonina.
Abstract
Un aspetto chiave della risposta immunitaria a colonizzazione batterica dell’host è la fagocitosi. Un’analisi di uccisione di anticorpli (OPKA) è una procedura sperimentale in cui le cellule fagocitiche sono co-coltivate con unità batterica. Le cellule immunitarie verranno fagocitare e uccidere le colture batteriche in modo complemento-dipendente. L’efficienza dell’uccisione delle cellule immuno-mediata è dipendente da una serie di fattori e può essere utilizzato per determinare batterica come le diverse culture confrontare per quanto riguarda la resistenza alla morte cellulare. In questo modo, può essere valutata l’efficacia di potenziali terapie basate su immunitario contro ceppi batterici specifici e/o sierotipi. In questo protocollo, descriviamo un OPKA semplificata che utilizza condizioni di cultura di base e delle cellule di conteggio per determinare la vitalità cellulare batterica dopo co-coltura con condizioni di trattamento e le cellule immunitarie di HL-60. Questo metodo è stato utilizzato con successo con un numero di diversi sierotipi pneumococcici, capsulari e ceppi di acapsular e altre specie batteriche. I vantaggi di questo protocollo OPKA sono la sua semplicità, versatilità (come questo test non è limitato ai trattamenti di anticorpo come opsonine) e la minimizzazione del tempo e reagenti per valutare gruppi sperimentali di base.
Introduction
L’anticorpli uccidendo assay (OPKA) sono uno strumento critico per il collegamento di alterazioni nella struttura batterica o funzione alle successive modifiche nella risposta immunitaria e la funzione. Come tale, esso è frequente come analisi complementare per determinare il sistema immunitario l’efficacia di trattamenti anticorpali, vaccini candidati, ottimizzazione degli enzimi, ecc. Saggi in vivo sono necessari per determinare l’effettiva liquidazione o protezione in un modello di infezione batterica, il OPKA può essere utilizzato per valutare il contributo immune alla morte delle cellule batteriche componenti di base al massimo: batteri, cellule immunitarie e sperimentale trattamenti. Gli studi precedenti hanno dimostrato che la OPKAs può essere modificato e utilizzato per una varietà di batteri e sierotipi, tra cui1di Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus aureus2, Pseudomonas aeruginosa3. Inoltre, queste analisi ottimizzate possono essere utilizzate per valutare i diversi trattamenti sperimentali, tra cui la possibilità di un enzima per rendere più accessibile ai trattamenti di4 e l’anticorpo di complemento-mediata di cellule immuni per migliorare il batterio opsonizzazione5. Classicamente, analisi di OPKA è stato utilizzato con successo nella ricerca clinica e di base impostazioni come un indicatore potente per la protezione indotta da anticorpi patogeni specifici6,7,8,9 .
Diversi tipi di cellule del sistema immunitario possono essere utilizzati per la valutazione dell’uccisione di anticorpli. Una popolazione fagocitica comunemente usato è la linea di cellule leucemiche umane HL-60. Questa linea cellulare può essere mantenuta come inattivato promielociti nella cultura; Tuttavia, possono essere differenziati in vari stati attivati via droga diversi trattamenti10,11. Trattamento di HL60 con N, N-dimetilformammide differenzia la linea cellulare in neutrofili attivati con forte attività fagocitica11. Mentre le cellule HL-60 sono state ottimizzate e sono frequentemente utilizzate per questi test di fagocitosi10, altri leucociti polimorfonucleari primari è utilizzabile come il braccio immune dell’ esperimento12.
Inoltre, queste analisi possono essere semplificata13 o multiplex14 a guardare più ceppi resistenti agli antibiotici dei batteri da testare. Il metodo multiplex è stato reso più fattibile attraverso lo sviluppo di software che può contare in modo efficiente Colonia batterica formando unità (CFUs) al posto su una piastra di agar15. Qui, descriviamo un metodo semplificato utilizzando un ceppo batterico, cellule HL-60, complemento di coniglio bambino e piastre di agar sangue. Con questo metodo, i trattamenti multipli possono essere valutati rapidamente per affrontare questioni di ricerche specifiche su come può essere modulata la risposta immunitaria innata alle infezioni batteriche.
Protocol
Representative Results
Discussion
OPKAs servire ruoli essenziali nella valutazione risposte immunitarie anticorpo mediata indotte dalla vaccinazione6,8. Il significato principale di questo OPKA semplificata è l’adattabilità nelle condizioni per essere testati (cioè, anticorpi, enzimi trattamenti, ecc.). In questo senso, mentre questo test può essere utilizzato per verificare il contributo di opsonine (cioè anticorpi) nella fagocitosi, può anche essere utilizzato per valutare il modo di supe…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo il dottor Moon Nahm (University of Alabama Birmingham) per la sua preziosa assistenza nella creazione di saggi OPKA nel nostro laboratorio. Questo lavoro è stato supportato da istituti nazionali di salute Grant 1R01AI123383-01A1 a FYA.
Materials
| Annexin V (APC conjugated) | BioLegend | 640919 | |
| anti-CD35, human (PE conjugated) | BioLegend | 333405 | |
| anti-CD71, human (PE conjugated) | BioLegend | 334105 | |
| bacterial strain to be used (ie, Streptococcus pneumoniae, WU2) | Bacterial Respiratory Reference Laboratory (Dr. Moon Nahm) | ||
| blood agar plates | Hardy Diagnostic | A10 | |
| Fetal Clone serum | HyClone | SH30080.03 | |
| glycerol | Sigma | G9012-1L | |
| HL-60 cells | ATCC | CCL-240 | |
| IgG Isotype Control (PE conjugated) | BioLegend | 400907 | |
| N,N-dimethylformamide (DMF) | Fisher Chemical | UN2265 | |
| propidium iodide | Sigma | P4864 | |
| RPMI media with L-glutamine | Corning | 10-040-CV |
References
- Romero-Steiner, S., et al. Standardization of an opsonophagocytic assay for the measurement of functional antibody activity against Streptococcus pneumoniae using differentiated HL-60 cells. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 4 (4), 415-422 (1997).
- Nanra, J. S., et al. Capsular polysaccharides are an important immune evasion mechanism for Staphylococcus aureus. Human Vaccines and Immunotherapeutics. 9 (3), 480-487 (2013).
- Ishibashi, K., Yamaguchi, O., Shiraiwa, Y., Ogihara, M., Shigeta, S. Combination therapy of Pseudomonas aeruginosa pyelonephritis in neutropenic mice with human antilipopolysaccharide monoclonal antibody and cefsulodin. Journal of Urology. 155 (6), 2094-2097 (1996).
- Middleton, D. R., Paschall, A. V., Duke, J. A., Avci, F. Y. Enzymatic Hydrolysis of Pneumococcal Capsular Polysaccharide Renders the Bacterium Vulnerable to Host Defense. Infection and Immunity. , (2018).
- Baker, C. J., Noya, F. J. Potential use of intravenous immune globulin for group B streptococcal infection. Reviews of Infectious Diseases. 12, 476-482 (1990).
- Tian, H., Weber, S., Thorkildson, P., Kozel, T. R., Pirofski, L. A. Efficacy of opsonic and nonopsonic serotype 3 pneumococcal capsular polysaccharide-specific monoclonal antibodies against intranasal challenge with Streptococcus pneumoniae in mice. Infection and Immunity. 77 (4), 1502-1513 (2009).
- Parameswarappa, S. G., et al. A Semi-synthetic Oligosaccharide Conjugate Vaccine Candidate Confers Protection against Streptococcus pneumoniae Serotype 3 Infection. Cell Chemical Biology. 23 (11), 1407-1416 (2016).
- Jackson, L., et al. Randomized clinical trial of a single versus a double dose of 13-valent pneumococcal conjugate vaccine in adults 55 through 74 years of age previously vaccinated with 23-valent pneumococcal polysaccharide vaccine. Vaccine. 36 (5), 606-614 (2018).
- Cywes-Bentley, C., et al. Antibody to a conserved antigenic target is protective against diverse prokaryotic and eukaryotic pathogens. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 110 (24), 2209-2218 (2013).
- Fleck, R. A., Romero-Steiner, S., Nahm, M. H. Use of HL-60 cell line to measure opsonic capacity of pneumococcal antibodies. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 12 (1), 19-27 (2005).
- Collins, S. J., Ruscetti, F. W., Gallagher, R. E., Gallo, R. C. Terminal differentiation of human promyelocytic leukemia cells induced by dimethyl sulfoxide and other polar compounds. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 75 (5), 2458-2462 (1978).
- Melnick, N., Rajam, G., Carlone, G. M., Sampson, J. S., Ades, E. W. Evaluation of a novel therapeutic approach to treating severe pneumococcal infection using a mouse model. Clinical and Vaccine Immunology. 16 (6), 806-810 (2009).
- Dwyer, M., Gadjeva, M. Opsonophagocytic assay. Methods in Molecular Biology. 1100, 373-379 (2014).
- Burton, R. L., Nahm, M. H. Development of a fourfold multiplexed opsonophagocytosis assay for pneumococcal antibodies against additional serotypes and discovery of serological subtypes in Streptococcus pneumoniae serotype 20. Clinical and Vaccine Immunololgy. 19 (6), 835-841 (2012).
- Clarke, M. L., et al. Low-cost, high-throughput, automated counting of bacterial colonies. Cytometry Part A. 77 (8), 790-797 (2010).
- Aanei, C. M., et al. Database-guided Flow-cytometry for Evaluation of Bone Marrow Myeloid Cell Maturation. Journal of Visualized Experiments. (141), e57867 (2018).
- Hirz, T., Dumontet, C. Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents. Journal of Visulaized Experiments. (109), e53846 (2016).
- Rieger, A. M., Nelson, K. L., Konowalchuk, J. D., Barreda, D. R. Modified annexin V/propidium iodide apoptosis assay for accurate assessment of cell death. Journal of Visualized Experiments. (50), 2597 (2011).
- Blair, O. C., Carbone, R., Sartorelli, A. C. Differentiation of HL-60 promyelocytic leukemia cells: simultaneous determination of phagocytic activity and cell cycle distribution by flow cytometry. Cytometry. 7 (2), 171-177 (1986).
- Middleton, D. R., et al. Identification and characterization of the Streptococcus pneumoniae type 3 capsule-specific glycoside hydrolase of Paenibacillus species 32352. Glycobiology. 28 (2), 90-99 (2018).
