Opsonophagocytic doden Assay te beoordelen van de immunologische reacties tegen bacteriële pathogenen
Summary
Deze opsonophagocytic doden test wordt gebruikt om te vergelijken het vermogen van fagocytische immuuncellen reageren op en doden van de bacteriën op basis van verschillende behandelingen en/of voorwaarden. Klassiek, dient deze bepaling als de gouden standaard voor het beoordelen van effector functies van antilichamen tegen een bacterie als opsonin aan de orde gesteld.
Abstract
Een belangrijk aspect van de immune reactie op bacteriële kolonisatie van de host is fagocytose. Een opsonophagocytic doden assay (OPKA) is een experimentele procedure waarin fagocytische cellen mede gekweekte met bacteriële eenheden zijn. De immune cellen zal phagocytose en doden van de bacteriële culturen in een aanvulling-afhankelijke manier. De efficiëntie van het doden van de immuun-gemedieerde cel is afhankelijk van een aantal factoren en kan worden gebruikt om te bepalen hoe verschillende bacteriële culturen vergelijken met betrekking tot resistentie tegen celdood. Op deze manier kan de werkzaamheid van potentiële immuun gebaseerde therapeutics tegen specifieke bacteriestammen en/of serotypen worden beoordeeld. In dit protocol beschrijven we een vereenvoudigde OPKA dat gebruik maakt van fundamentele kweekomstandigheden en cel tellen om te bepalen van de levensvatbaarheid van de bacteriële cellen na co cultuur met behandeling voorwaarden en HL-60 immuuncellen. Deze methode is met succes gebruikt met een aantal verschillende pneumokokken serotypen, kapselvorming en acapsular stammen, en andere bacteriële soorten. De voordelen van dit protocol OPKA zijn zijn eenvoud, veelzijdigheid (zoals deze bepaling niet beperkt tot antilichaam behandelingen als opsonins is), en minimalisering van tijd en reagentia te beoordelen van experimentele basisgroepen.
Introduction
De opsonophagocytic doden assay (OPKA) is een essentiële tool voor wijzigingen in de bacteriële structuur of functie te koppelen aan latere wijzigingen in de immuunrespons en functie. Als zodanig, wordt het vaak gebruikt als een aanvullende test om te bepalen van immuun gebaseerde werkzaamheid van antilichaam behandelingen, vaccin kandidaten, enzym optimalisatie, enz. Terwijl in vivo tests nodig zijn om te bepalen van de effectieve goedkeuring of bescherming in het model van een bacteriële infectie, de OPKA kan worden gebruikt voor het beoordelen van immuun bijdrage tot de bacteriële celdood op het meest elementaire componenten: bacteriën, immune cellen, en experimentele behandelingen. Eerdere studies hebben aangetoond dat OPKAs kan worden bewerkt en voor een verscheidenheid van bacteriën en serotypen gebruikt, met inbegrip van1van de Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus aureus2, Pseudomonas aeruginosa3. Bovendien, deze geoptimaliseerde testen kunnen worden gebruikt voor het beoordelen van de verschillende experimentele behandelingen, met inbegrip van de mogelijkheid van een enzym dat de bacterie meer toegankelijk maken voor aanvulling-gemedieerde immuun cellen4 en antilichaam behandelingen te verbeteren opsonization5. Klassiek, OPKA assay is met succes gebruikt in fundamenteel en klinisch onderzoek instellingen als een krachtige indicator voor bescherming geïnduceerd door pathogeen-specifieke antilichamen6,7,8,9 .
Verschillende soorten immuuncellen kunnen worden gebruikt voor de beoordeling van opsonophagocytic doden. Een veelgebruikte fagocytische bevolking is de HL-60 menselijke leukemische cellijn. Deze cellijn kan worden gehouden als geïnactiveerd promyelocytes in cultuur; ze kunnen echter worden gedifferentieerd in verschillende geactiveerde Staten via verschillende drug behandelingen10,11. Behandeling van HL60 met N, N-dimethylformamide onderscheidt de cellijn in geactiveerde neutrofiele granulocyten met sterke fagocytische activiteit11. Terwijl HL-60-cellen zijn geoptimaliseerd en vaak voor deze fagocytose testen10 gebruikt worden, kunnen de andere primaire polymorfonucleaire leukocyten worden gebruikt als immuun arm van het experiment12.
Daarnaast kunnen deze gehaltebepalingen vereenvoudigde13 of14 te kijken naar meerdere antibiotica-resistente stammen van de bacteriën te beproeven multiplexed. De multiplexed methode geboekt meer haalbaar door de ontwikkeling van de software die efficiënt bacteriële kolonievormende eenheden (CFUs) per plek op een agar plaat15kan rekenen. Hier beschrijven we een gestroomlijnde methode met behulp van een bacteriële stam, HL-60 cellen baby konijn aanvulling en bloed agar platen. Met deze methode kunnen meerdere behandelingen snel worden beoordeeld om specifieke onderzoeksvragen op hoe de ingeboren immune reactie op bacteriële infectie kan worden gedifferentieerd.
Protocol
Representative Results
Discussion
OPKAs dienen een essentiële rol bij de beoordeling van antilichaam gemedieerde immuunreacties geïnduceerd door vaccinaties6,8. De belangrijkste betekenis van dit vereenvoudigde OPKA is het aanpassingsvermogen in de voorwaarden te beproeven (dat wil zeggen, antilichamen, enzym behandelingen, enz.). In deze zin, terwijl deze bepaling kan worden gebruikt voor het testen van de bijdrage van opsonins (dat wil zeggen, antistoffen) in fagocytose, kan het ook worden ge…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Dr. Moon Nahm (Universiteit van Alabama Birmingham) voor zijn onschatbare hulp bij het vaststellen van OPKA testen in ons laboratorium. Dit werk werd gesteund door de nationale instituten van gezondheid Grant 1R01AI123383-01A1 naar FYA.
Materials
| Annexin V (APC conjugated) | BioLegend | 640919 | |
| anti-CD35, human (PE conjugated) | BioLegend | 333405 | |
| anti-CD71, human (PE conjugated) | BioLegend | 334105 | |
| bacterial strain to be used (ie, Streptococcus pneumoniae, WU2) | Bacterial Respiratory Reference Laboratory (Dr. Moon Nahm) | ||
| blood agar plates | Hardy Diagnostic | A10 | |
| Fetal Clone serum | HyClone | SH30080.03 | |
| glycerol | Sigma | G9012-1L | |
| HL-60 cells | ATCC | CCL-240 | |
| IgG Isotype Control (PE conjugated) | BioLegend | 400907 | |
| N,N-dimethylformamide (DMF) | Fisher Chemical | UN2265 | |
| propidium iodide | Sigma | P4864 | |
| RPMI media with L-glutamine | Corning | 10-040-CV |
References
- Romero-Steiner, S., et al. Standardization of an opsonophagocytic assay for the measurement of functional antibody activity against Streptococcus pneumoniae using differentiated HL-60 cells. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 4 (4), 415-422 (1997).
- Nanra, J. S., et al. Capsular polysaccharides are an important immune evasion mechanism for Staphylococcus aureus. Human Vaccines and Immunotherapeutics. 9 (3), 480-487 (2013).
- Ishibashi, K., Yamaguchi, O., Shiraiwa, Y., Ogihara, M., Shigeta, S. Combination therapy of Pseudomonas aeruginosa pyelonephritis in neutropenic mice with human antilipopolysaccharide monoclonal antibody and cefsulodin. Journal of Urology. 155 (6), 2094-2097 (1996).
- Middleton, D. R., Paschall, A. V., Duke, J. A., Avci, F. Y. Enzymatic Hydrolysis of Pneumococcal Capsular Polysaccharide Renders the Bacterium Vulnerable to Host Defense. Infection and Immunity. , (2018).
- Baker, C. J., Noya, F. J. Potential use of intravenous immune globulin for group B streptococcal infection. Reviews of Infectious Diseases. 12, 476-482 (1990).
- Tian, H., Weber, S., Thorkildson, P., Kozel, T. R., Pirofski, L. A. Efficacy of opsonic and nonopsonic serotype 3 pneumococcal capsular polysaccharide-specific monoclonal antibodies against intranasal challenge with Streptococcus pneumoniae in mice. Infection and Immunity. 77 (4), 1502-1513 (2009).
- Parameswarappa, S. G., et al. A Semi-synthetic Oligosaccharide Conjugate Vaccine Candidate Confers Protection against Streptococcus pneumoniae Serotype 3 Infection. Cell Chemical Biology. 23 (11), 1407-1416 (2016).
- Jackson, L., et al. Randomized clinical trial of a single versus a double dose of 13-valent pneumococcal conjugate vaccine in adults 55 through 74 years of age previously vaccinated with 23-valent pneumococcal polysaccharide vaccine. Vaccine. 36 (5), 606-614 (2018).
- Cywes-Bentley, C., et al. Antibody to a conserved antigenic target is protective against diverse prokaryotic and eukaryotic pathogens. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 110 (24), 2209-2218 (2013).
- Fleck, R. A., Romero-Steiner, S., Nahm, M. H. Use of HL-60 cell line to measure opsonic capacity of pneumococcal antibodies. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 12 (1), 19-27 (2005).
- Collins, S. J., Ruscetti, F. W., Gallagher, R. E., Gallo, R. C. Terminal differentiation of human promyelocytic leukemia cells induced by dimethyl sulfoxide and other polar compounds. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 75 (5), 2458-2462 (1978).
- Melnick, N., Rajam, G., Carlone, G. M., Sampson, J. S., Ades, E. W. Evaluation of a novel therapeutic approach to treating severe pneumococcal infection using a mouse model. Clinical and Vaccine Immunology. 16 (6), 806-810 (2009).
- Dwyer, M., Gadjeva, M. Opsonophagocytic assay. Methods in Molecular Biology. 1100, 373-379 (2014).
- Burton, R. L., Nahm, M. H. Development of a fourfold multiplexed opsonophagocytosis assay for pneumococcal antibodies against additional serotypes and discovery of serological subtypes in Streptococcus pneumoniae serotype 20. Clinical and Vaccine Immunololgy. 19 (6), 835-841 (2012).
- Clarke, M. L., et al. Low-cost, high-throughput, automated counting of bacterial colonies. Cytometry Part A. 77 (8), 790-797 (2010).
- Aanei, C. M., et al. Database-guided Flow-cytometry for Evaluation of Bone Marrow Myeloid Cell Maturation. Journal of Visualized Experiments. (141), e57867 (2018).
- Hirz, T., Dumontet, C. Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents. Journal of Visulaized Experiments. (109), e53846 (2016).
- Rieger, A. M., Nelson, K. L., Konowalchuk, J. D., Barreda, D. R. Modified annexin V/propidium iodide apoptosis assay for accurate assessment of cell death. Journal of Visualized Experiments. (50), 2597 (2011).
- Blair, O. C., Carbone, R., Sartorelli, A. C. Differentiation of HL-60 promyelocytic leukemia cells: simultaneous determination of phagocytic activity and cell cycle distribution by flow cytometry. Cytometry. 7 (2), 171-177 (1986).
- Middleton, D. R., et al. Identification and characterization of the Streptococcus pneumoniae type 3 capsule-specific glycoside hydrolase of Paenibacillus species 32352. Glycobiology. 28 (2), 90-99 (2018).
