Microscopía de seguimiento de una sola molécula - Una herramienta para determinar los estados difusos de las moléculas citosólicas

El examen del comportamiento difuso de las biomoléculas proporciona información sobre sus funciones biológicas. Las técnicas basadas en la microscopía de fluorescencia se han convertido en herramientas valiosas para observar biomoléculas en su entorno celular nativo. La recuperación de fluorescencia después del fotoblanqueo (FRAP) y la espectroscopia de correlación de fluorescencia (FCS)¹ proporcionan comportamientos difusivos promediados por el conjunto. Por el contrario, la microscopía de localización de una sola molécula permite la observación de moléculas individuales etiquetadas fluorescentes con alta resolución espacial y temporal^2,3,4. Observar moléculas individuales es ventajoso ya que puede existir una proteína de interés en diferentes estados difusivos. Por ejemplo, dos estados difusivos fácilmente distinguibles surgen cuando un regulador transcripcional, como El CueR en Escherichia coli, se difunde libremente en el citosol o se une a una secuencia de ADN y se inmoviliza en la escala temporal de la medición⁵ . El seguimiento de una sola molécula proporciona una herramienta para observar estos diferentes estados directamente, y no se requieren análisis sofisticados para resolverlos. Sin embargo, se vuelve más difícil resolver múltiples estados difusos y sus fracciones de población en casos en los que sus tasas difusas son más similares. Por ejemplo, debido a la dependencia del tamaño del coeficiente de difusión, los diferentes estados de oligomerización de una proteína se manifiestan como diferentes estados difusores^{6,7,8,9 , 10}. Estos casos requieren un enfoque integrado en términos de adquisición, procesamiento y análisis de datos.

Un factor crítico que influye en las tasas difusas de las moléculas citosólicas es el efecto del confinamiento por el límite celular. Las restricciones impuestas al movimiento molecular por un límite de células bacterianas hacen que la tasa de difusión medida de una moléculacitos parezca más lenta que si el mismo movimiento hubiera ocurrido en un espacio no confinado. Para moléculas que difuminan muy lentamente, el efecto del confinamiento celular es insignificante debido a la falta de colisiones con el límite. En tales casos, puede ser posible resolver con precisión estados difusos ajustando las distribuciones de los desplazamientos moleculares, r,o coeficientes de difusión aparentes, D*,utilizando modelos analíticos basados en las ecuaciones para el movimiento Browniano ( difusión aleatoria)^11,12,13. Sin embargo, para la rápida difusión de moléculas citosólicas, las distribuciones experimentales ya no se asemejan a las obtenidas para el movimiento Browniano no confinado debido a colisiones de moléculas difusoras con los límites celulares. Los efectos de confinamiento deben tenerse en cuenta para determinar con precisión los coeficientes de difusión no confinados de las moléculas etiquetadas fluorescentemente. Recientemente se han desarrollado varios enfoques para tener en cuenta los efectos de confinamiento (semi-)analíticamente ^5,14,15,16 o numéricamente a través de simulaciones de Monte Carlo de Difusión Browniana^{6,10,16,17,18,19}.

Aquí, proporcionamos un protocolo integrado para recopilar y analizar datos de microscopía de localización de una sola molécula con un enfoque particular en el seguimiento de una sola molécula. El objetivo final del protocolo es resolver estados difusos de proteínas citosólicas etiquetadas fluorescentemente en el interior, en este caso, células bacterianas en forma de varilla. Nuestro trabajo se basa en un protocolo anterior para el seguimiento de una sola molécula, en el que se demostró que existe una polimerasa de ADN, PolI, en un estado unido y sin enlazar el ADN mediante el análisis de difusión^20. Aquí, ampliamos el análisis de seguimiento de una sola molécula a mediciones 3D y realizamos simulaciones computacionales más realistas para resolver y cuantificar múltiples estados difusivos presentes simultáneamente en las células. Los datos se adquieren utilizando un microscopio de fluorescencia de superresolución 3D construido en casa que es capaz de determinar la posición 3D de los emisores fluorescentes mediante imágenes con la función de difusión por puntos de doble hélice (DHPSF)^21,22. Las imágenes de una sola molécula en bruto se procesan utilizando software escrito a medida para extraer las localizaciones 3D de una sola molécula, que luego se combinan en trayectorias de una sola molécula. Miles de trayectorias se agrupan para generar distribuciones de coeficientes de difusión aparentes. En un último paso, las distribuciones experimentales se ajustan a las distribuciones generadas numéricamente obtenidas a través de simulaciones de Montecarlo de movimiento Browniano en un volumen confinado. Aplicamos este protocolo para resolver los estados difusivos de la proteína del sistema de secreción Tipo 3 YscQ en Yersinia enterocoliticaviva. Debido a su naturaleza modular, nuestro protocolo es generalmente aplicable a cualquier tipo de experimento de seguimiento de una sola molécula o de una sola partícula en geometrías celulares arbitrarias.