Одномолекулярная слежение за микроскопией - инструмент для определения диффузивных состояний цитосолильных молекул

Изучение диффузивного поведения биомолекул дает представление об их биологических функциях. Методы, основанные на флуоресценции, стали ценными инструментами для наблюдения за биомолекулами в их родной клеточной среде. Восстановление флуоресценции после фотоотрубения (FRAP) и флуоресцентной корреляции спектроскопии (FCS)¹ обеспечивают ансамбль-средний диффузивного поведения. И наоборот, одномолекулярная локализация микроскопии позволяет наблюдать за отдельными флуоресцентно отмеченными молекулами с высоким пространственным и временным разрешением^2,3,4. Наблюдение отдельных молекул выгодно, так как интересующий белок может существовать в различных диффузивных состояниях. Например, два легко различимых диффузионных состояния возникают, когда транскрипционный регулятор, такой как CueR в Escherichia coli,свободно рассеивается в цитозоле или связывается с последовательностью ДНК и становится обездвижемым по шкале времени измерения⁵ . Одномолекулярное слежение обеспечивает инструмент для непосредственного наблюдения за этими различными состояниями, и для их разрешения не требуется сложных анализов. Тем не менее, становится все более сложным для решения нескольких диффузивных государств и их населения фракций в тех случаях, когда их диффузионные ставки более похожи. Например, из-за зависимости размера коэффициента диффузии различные состояния олигомеризации белка проявляются как различные диффузионные состояния^{6,7,8,9 , 10}. Такие случаи требуют комплексного подхода с точки зрения сбора, обработки и анализа данных.

Критическим фактором, влияющим на диффузивные темпы цитосолильных молекул, является эффект заточения клеточной границы. Ограничения, наложенные на молекулярное движение границами бактериальных клеток, приводят к тому, что измеренная скорость диффузии цитосолильных молекул выглядит медленнее, чем если бы то же самое движение происходило в неограниченном пространстве. Для очень медленно рассеивающихся молекул эффект клеточного заточения незначителен из-за отсутствия столкновений с границей. В таких случаях, это может быть возможным для точного решения диффузионных состояний путем установки распределения молекулярных смещений, r, или очевидной диффузии коэффициенты, D ,с помощью аналитических моделей, основанных на уравнениях для броуновского движения ( случайная диффузия)^11,12,13. Однако для быстро распространяющих цитосолильных молекул экспериментальные распределения больше не напоминают те, которые получены для неограниченного броуновского движения из-за столкновений диффузионных молекул с границами клеток. Эффекты заключения должны быть учтены для точного определения неограниченных коэффициентов диффузии флуоресцентно обозначенных молекул. Несколько подходов были недавно разработаны для учета последствий заключения либо (полу-) аналитически ^5,14,15,16 или численно через Монте-Карло моделирования Броуновская диффузия^{6,10,16,17,18,19}.

Здесь мы предоставляем интегрированный протокол для сбора и анализа данных одномолекулярной локализации микроскопии с особым акцентом на одномолекулярное отслеживание. Конечная цель протокола заключается в разрешении диффузивных состояний флуоресцентно обозначенных цитосолильных белков внутри, в данном случае, бактериальных клеток в форме стержня. Наша работа основывается на предыдущем протоколе для одномолекулярной слежения, в котором полимераза ДНК, PolI, было показано, существуют в ДНК связаны и несвязанное состояние диффузии анализа²⁰. Здесь мы расширяем одномолекулярный анализ слежения до 3D-измерений и выполняем более реалистичные вычислительные симуляции для разрешения и количественной оценки нескольких диффузивных состояний, одновременно присутствующих в клетках. Данные приобретаются с помощью домашнего 3D супер-разрешение флуоресценции микроскоп, который способен определить 3D положение флуоресцентных излучателей с помощью изображения с двойной селипс точки распространения-функции (DHPSF)^21,22. Необработанные одномолекулярные изображения обрабатываются с помощью специально написанного программного обеспечения для извлечения 3D одномолекулярных локализаций, которые затем объединяются в одномолекулярные траектории. Тысячи траекторий объединяются для генерации распределения явных коэффициентов диффузии. На последнем этапе экспериментальные дистрибутивы соответствуют численно генерируемым дистрибутивам, полученным с помощью моделирования броуновского движения Монте-Карло в ограниченном объеме. Мы применяем этот протокол для решения диффузивных состояний белка секреционной системы типа 3 Ysc, в живых Yersinia enterocolitica. Из-за своей модульной природы, наш протокол, как правило, применим к любому типу одномолекулярных или одночастиц слежения эксперимента в произвольной геометрии клеток.