JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
生物化学

مجهريتتبع جزيء واحد - أداة لتحديد الدول المنافية للجزيئات الخلوية

Published: September 05, 2019
doi:
10.3791/59387
,
1Department of Chemistry,University of Virginia, 2Department of Molecular Physiology & Biological Physics,University of Virginia School of Medicine

Summary

يتم استخدام الفحص المجهري لتوطين جزيء واحد ثلاثي الدمنل لسبر المواقف المكانية ومسارات الحركة للبروتينات ذات العلامات الفلورية في الخلايا البكتيرية الحية. يحدد بروتوكول تحليل البيانات التجريبية الموضحة هنا السلوكيات المشتتة السائدة للبروتينات الخلوية استناداً إلى مسارات أحادية الجزيء مجمعة.

Abstract

يسبر الفحص المجهري لتوطين جزيء واحد موضع وحركات الجزيئات الفردية في الخلايا الحية مع عشرات النانومتر المكاني والاستبانة الزمنية المليثانية. هذه القدرات تجعل من جزيء واحد التعريب المجهري ة مناسبة بشكل مثالي لدراسة الوظائف البيولوجية على المستوى الجزيئي في البيئات ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية. هنا، نقوم بتوضيح بروتوكول متكامل لكل من الحصول على ومعالجة/تحليل بيانات تتبع جزيء واحد لاستخراج مختلف الدول المشتتة التي قد تظهر البروتين ذات الأهمية. ويمكن استخدام هذه المعلومات لتحديد كمية تشكيل المعقدة الجزيئية في الخلايا الحية. نحن نقدم وصفا مفصلا لتجربة توطين جزيء واحد 3D المستندة إلى الكاميرا، فضلا عن خطوات معالجة البيانات اللاحقة التي تسفر عن مسارات الجزيئات الفردية. ثم يتم تحليل هذه المسارات باستخدام إطار تحليل عددي لاستخراج الحالات الانقباحية السائدة للجزيئات التي تحمل علامة الفلورسنت والوفرة النسبية لهذه الدول. ويستند إطار التحليل إلى عمليات محاكاة استوكاستك لمسارات الانتشار البنيداخل الخلايا التي تقتصر مكانياً على هندسة الخلايا التعسفية. استناداً إلى مسارات محاكاة، يتم إنشاء الصور الخام جزيء واحد وتحليلها بنفس الطريقة مثل الصور التجريبية. وبهذه الطريقة، فإن القيود التجريبية على الدقة والدقة، التي يصعب معايرة تجريبياً، تُدمج صراحة في سير عمل التحليل. يتم تحديد معامل الانتشار والكسور السكانية النسبية للحالات المشتتة السائدة عن طريق تركيب توزيعات القيم التجريبية باستخدام تركيبات خطية من التوزيعات المحاكاة. نحن نبرهن على فائدة بروتوكولنا من خلال حل الحالات المنافية للبروتين الذي يعرض حالات مختلفة من عدم الاكتراث عند تشكيل المجمعات المتجانسة والمتغايّرة القلة في السيتوسول من مسببات الأمراض البكتيرية.

Introduction

دراسة السلوك المختلف للجزيئات الحيوية يوفر نظرة ثاقبة في وظائفها البيولوجية. أصبحت التقنيات المستندة إلى التنظير المجهري الفلوري أدوات قيمة لمراقبة الجزيئات الحيوية في بيئة الخلايا الأصلية الخاصة بها. الانتعاش الفلوري بعد تبييض الصور (FRAP) ومطياف الارتباط الفلوري (FCS)1 توفير السلوكيات الفرقية متوسط الفرقة. وعلى العكس من ذلك، فإن الفحص المجهري لتوطين جزيء واحد يتيح مراقبة الجزيئات الفردية ذات العلامات الفلورية ذات الدقة المكانية والزمنية العالية2و3و4. مراقبة الجزيئات الفردية مفيد لأن البروتين من الفائدة قد توجد في حالات مختلفة من عدم الأهمية. على سبيل المثال، تنشأ دولتان مختلفتان يمكن تمييزهما بسهولة عندما ينتشر منظم النسخ، مثل CueR في الإشريكية القولونية، بحرية في السيتوسول أو يرتبط بتسلسل الحمض النووي ويصبح معطلة على المقياس الزمني للقياس5 . يوفر تتبع جزيء واحد أداة لمراقبة هذه الدول المختلفة مباشرة، وليس هناك حاجة إلى تحليلات متطورة لحلها. ومع ذلك، يصبح من الصعب أكثر حل حالات متعددة غير مُقابَّلة وكسور سكانها في الحالات التي تكون فيها معدلاتها المشتتة أكثر تشابهاً. على سبيل المثال، بسبب الاعتماد على حجم معامل الانتشار، تظهر حالات القلة المختلفة للبروتين نفسها كحالات مختلفة غير مُقَدِّمة6و7و8و9 , 10– وتتطلب هذه الحالات نهجا متكاملا من حيث الحصول على البيانات وتجهيزها وتحليلها.

ومن العوامل الحاسمة التي تؤثر على المعدلات المختلفة للجزيئات الكليوم أثر الحبس بحدود الخلية. وتتسبب القيود المفروضة على الحركة الجزيئية من قبل حد الخلية البكتيرية في أن يظهر معدل الانتشار المقاس للجزيئات الكلوسالية أبطأ مما لو كان نفس الحركة قد حدث في مساحة غير محصورة. بالنسبة للجزيئات التي تنتشر ببطء شديد، فإن تأثير الحبس الخلوي لا يكاد يذكر بسبب عدم وجود تصادمات مع الحدود. في مثل هذه الحالات، قد يكون من الممكن حل الحالات المشتتة بدقة عن طريق تركيب توزيعات الإزاحات الجزيئية، ص،أو معاملات الانتشار الظاهرة، D*، باستخدام نماذج تحليلية تستند إلى معادلات الحركة البراونية ( نشر عشوائي)11،12،13. ومع ذلك، لنشر الجزيئات الخلوية بسرعة، والتوزيعات التجريبية لم تعد تشبه تلك التي تم الحصول عليها للحركة براونيان غير المحصورة بسبب اصطدام الجزيئات الناشرة مع حدود الخلية. يجب حساب آثار الحبس لتحديد معاملات الانتشار غير المحصورة للجزيئات التي تحمل علامة الفلورسنت بدقة. وقد وضعت مؤخرا عدة نهج لحساب آثار الحبس إما (شبه)تحليليا 5،14،15،16 أو عدديا من خلال محاكاة مونتي كارلو من نشر براونيان6،10،16،17،18،19.

هنا، نحن نقدم بروتوكول متكامل لجمع وتحليل البيانات المجهرية توطين جزيء واحد مع التركيز بشكل خاص على تتبع جزيء واحد. الهدف النهائي للبروتوكول هو حل الحالات المنافية للبروتينات السيتوفورية التي تحمل علامة الفلوروس داخل، في هذه الحالة، الخلايا البكتيرية على شكل قضيب. ويستند عملنا على بروتوكول سابق لتتبع جزيء واحد، الذي تم تبين أن بوليميراز الحمض النووي، PolI، موجودة في حالة الحمض النووي ملزمة وغير منضمة عن طريق تحليل نشر20. هنا، نقوم بتوسيع تحليل تتبع جزيء واحد إلى قياسات 3D وإجراء محاكاة حسابية أكثر واقعية لحل وقياس حالات مختلفة في وقت واحد موجودة في الخلايا. يتم الحصول على البيانات باستخدام مجهر الفلورة فائقة الدقة 3D بنيت في المنزل والتي هي قادرة على تحديد موقف 3D من باعثات الفلورسنت عن طريق التصوير مع مزدوج الحلزون نقطة انتشار وظيفة (DHPSF)21،22. تتم معالجة الصور الخام ذات الجزيء الواحد باستخدام برامج مكتوبة حسب الطلب لاستخراج التعريب ثلاثي الأبعاد أحادي الجزيء، والتي يتم دمجها بعد ذلك في مسارات أحادية الجزيء. يتم تجميع الآلاف من المسارات لتوليد توزيعات معاملات الانتشار الظاهرة. في خطوة أخيرة, تتناسب التوزيعات تجريبيّة مع عدديّا ينتج توزيعات ينال من خلال [مونت-كرلو] محاكاة من حركة [بروونين] في حجم يحصر. نحن نطبق هذا البروتوكول لحل حالات عدم الانتشار من نوع 3 إفراز نظام البروتين YscQ في العيش Yersinia enterocolitica. نظرًا لطبيعته النمطية، فإن بروتوكولنا ينطبق بشكل عام على أي نوع من تجارب تتبع الجزيئات الواحدة أو الجسيمات الواحدة في الجيومتريات الخلوية التعسفية.

Protocol

1. مزدوج الحلزون نقطة انتشار وظيفة المعايرة 2. ملاحظة: يتم الحصول على الصور الموضحة في هذا القسم والأقسام التالية باستخدام مجهر الفلورة المقلوب المبني ة حسب الطلب، كما هو موضح في Rocha et al.23. نفس الإجراء ينطبق على تطبيقات المجهر المختلفة المصممة لتوطين جزيء واحد وتت?…

Representative Results

في ظل الظروف التجريبية الموصوفة هنا (20،000 لقطة، طول المسار الحد الأدنى من 4 التعريب) واعتمادا على مستويات التعبير من البروتينات الانصهار المسمى الفلورسنت، ما يقرب من 200-3،000 التعريب تسفر عن 10-150 يمكن إنشاء مسارات لكل خلية(الشكل 2a،ب). وهناك عدد كبير م…

Discussion

والعامل الحاسم للتطبيق الناجح للبروتوكول المعروض هو ضمان فصل إشارات الجزيء الواحد بشكل جيد عن بعضها البعض (أي أنها تحتاج إلى أن تكون متفرقة في الفضاء وفي الوقت المناسب(Supplementary Mov. 1)). إذا كان هناك أكثر من جزيء مفلور واحد في خلية في نفس الوقت، ثم يمكن تعيين التعريب بشكل غير صحيح إلى م…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

نشكر أليسيا أكيموفيتش وتينغ يان على قراءتهما النقدية للمخطوطة. نشكر إد هول، كبير علماء الموظفين في مجموعة خدمات الحوسبة البحثية المتقدمة في جامعة فرجينيا، على المساعدة في إعداد إجراءات التحسين المستخدمة في هذا العمل. وقدمت جامعة فرجينيا التمويل اللازم لهذا العمل.

Materials

2,6-diaminopimelic acid Chem Impex International 5411 Necessary for growth of Y. enterocolitica cells used.
4f lenses Thorlabs AC508-080-A f = 80mm, 2"
514 nm laser Coherent Genesis MX514 MTM Use for fluorescence excitation
agarose Inivtrogen 16520100 Used to make gel pads to mount liquid bacterial sample on microscope.
ammonium chloride Sigma Aldrich A9434 M2G ingredient.
bandpass filter Chroma ET510/bp Excitation pathway.
Brain Heart Infusion Sigma Aldrich 53286 Growth media for Y. enterocolitica.
calcium chloride Sigma Aldrich 223506 M2G ingredient.
camera Imaging Source DMK 23UP031 Camera for phase contrast imaging.
dielectric phase mask Double Helix, LLC N/A Produces DHPSF signal.
disodium phosphate Sigma Aldrich 795410 M2G ingredient.
ethylenediaminetetraacetic acid Fisher Scientific S311-100 Chelates Ca2+. Induces secretion in the T3SS.
flip mirror Newport 8892-K Allows for switching between fluorescence and phase contrast pathways.
fluospheres Invitrogen F8792 Fluorescent beads. 540/560 exication and emission wavelengths. 40 nm diameter.
glass cover slip VWR 16004-302 #1.5, 22mmx22mm
glucose Chem Impex International 811 M2G ingredient.
immersion oil Olympus Z-81025 Placed on objective lens.
iron(II) sulfate Sigma Aldrich F0518 M2G ingredient.
long pass filter Semrock LP02-514RU-25 Emission pathway.
magnesium sulfate Fisher Scientific S25414A M2G ingredient.
microscope platform Mad City Labs custom Platform for inverted microscope.
nalidixic acid Sigma Aldrich N4382 Y. enterocolitica cells used are resistant to nalidixic acid.
objective lens Olympus 1-U2B991 60X, 1.4 NA
Ozone cleaner Novascan PSD-UV4 Used to eliminate background fluorescence on glass cover slips.
potassium phosphate Sigma Aldrich 795488 M2G ingredient.
Red LED Thorlabs M625L3 Illuminates sample for phase contrast imaging. 625nm.
sCMOS camera Hamamatsu ORCA-Flash 4.0 V2 Camera for fluorescence imaging.
short pass filter Chroma ET700SP-2P8 Emission pathway.
Tube lens Thorlabs AC508-180-A f=180 mm, 2"
Yersinia enterocolitica dHOPEMTasd N/A N/A Strain AD4442, eYFP-YscQ
zero-order quarter-wave plate Thorlabs WPQ05M-514 Excitation pathway.
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kapanidis, A. N., Uphoff, S., Stracy, M. Understanding Protein Mobility in Bacteria by Tracking Single Molecules. Journal of Molecular Biology. , (2018).
  2. Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
  3. Hess, S. T., Girirajan, T. P. K., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophysical Journal. 91 (11), 4258-4272 (2006).
  4. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. W. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
  5. Chen, T. Y., et al. Quantifying Multistate Cytoplasmic Molecular Diffusion in Bacterial Cells via Inverse Transform of Confined Displacement Distribution. Journal of Physical Chemistry B. 119 (45), 14451-14459 (2015).
  6. Mohapatra, S., Choi, H., Ge, X., Sanyal, S., Weisshaar, J. C. Spatial Distribution and Ribosome-Binding Dynamics of EF-P in Live Escherichia coli. mBio. 8 (3), (2017).
  7. Stracy, M., et al. Single-molecule imaging of UvrA and UvrB recruitment to DNA lesions in living Escherichia coli. Nature Communications. 7, 12568 (2016).
  8. Persson, F., Lindén, M., Unoson, C., Elf, J. Extracting intracellular diffusive states and transition rates from single-molecule tracking data. Nature Methods. 10 (3), 265-269 (2013).
  9. Bakshi, S., Choi, H., Weisshaar, J. C. The spatial biology of transcription and translation in rapidly growing Escherichia coli. Frontiers in Microbiology. 6, 636 (2015).
  10. Mustafi, M., Weisshaar, J. C. Simultaneous Binding of Multiple EF-Tu Copies to Translating Ribosomes in Live Escherichia coli. mBio. 9 (1), (2018).
  11. Michalet, X., Berglund, A. J. Optimal diffusion coefficient estimation in single-particle tracking. Physical Review E. 85 (6), (2012).
  12. Michalet, X. Mean square displacement analysis of single-particle trajectories with localization error: Brownian motion in an isotropic medium. Physical Review E Statistical, Nonlinear, and Soft Matter Physics. 82 (4 Pt 1), 041914 (2010).
  13. Backlund, M. P., Joyner, R., Moerner, W. E. Chromosomal locus tracking with proper accounting of static and dynamic errors. Physical Review E Statistical, Nonlinear, and Soft Matter Physics. 91 (6), 062716 (2015).
  14. Stracy, M., et al. Live-cell superresolution microscopy reveals the organization of RNA polymerase in the bacterial nucleoid. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (32), E4390-E4399 (2015).
  15. Plochowietz, A., Farrell, I., Smilansky, Z., Cooperman, B. S., Kapanidis, A. N. In vivo single-RNA tracking shows that most tRNA diffuses freely in live bacteria. Nucleic Acids Research. 45 (2), 926-937 (2017).
  16. Koo, P. K., Mochrie, S. G. Systems-level approach to uncovering diffusive states and their transitions from single-particle trajectories. Physical Review E. 94 (5-1), 052412 (2016).
  17. Uphoff, S., Reyes-Lamothe, R., Garza de Leon, F., Sherratt, D. J., Kapanidis, A. N. Single-molecule DNA repair in live bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (20), 8063-8068 (2013).
  18. Bakshi, S., Bratton, B. P., Weisshaar, J. C. Subdiffraction-Limit Study of Kaede Diffusion and Spatial Distribution in Live Escherichia coli. Biophysical Journal. 101 (10), 2535-2544 (2011).
  19. Bakshi, S., Siryaporn, A., Goulian, M., Weisshaar, J. C. Superresolution imaging of ribosomes and RNA polymerase in live Escherichia coli cells. Molecular Microbiology. 85 (1), 21-38 (2012).
  20. Uphoff, S., Sherratt, D. J., Kapanidis, A. N. Visualizing Protein-DNA Interactions in Live Bacterial Cells Using Photoactivated Single-molecule Tracking. JoVE. (85), e51177 (2014).
  21. Pavani, S. R. P., Piestun, R. Three dimensional tracking of fluorescent microparticles using a photon-limited double-helix response system. Optics Express. 16 (26), 22048-22057 (2008).
  22. Pavani, S. R. P., et al. Three-dimensional, single-molecule fluorescence imaging beyond the diffraction limit by using a double-helix point spread function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (9), 2995-2999 (2009).
  23. Rocha, J. M., et al. Single-molecule tracking in live Yersinia enterocolitica reveals distinct cytosolic complexes of injectisome subunits. Integrative Biology. 10 (9), 502-515 (2018).
  24. Lew, M. D., von Diezmann, A. R. S., Moerner, W. E. Easy-DHPSF open-source software for three-dimensional localization of single molecules with precision beyond the optical diffraction limit. Protocol Exchange. , (2013).
  25. Biteen, J. S., et al. Super-resolution imaging in live Caulobacter crescentus cells using photoswitchable EYFP. Nature Methods. 5 (11), 947-949 (2008).
  26. Huang, F., et al. Video-rate nanoscopy using sCMOS camera-specific single-molecule localization algorithms. Nature Methods. 10 (7), 653-658 (2013).
  27. Hoogendoorn, E., et al. The fidelity of stochastic single-molecule super-resolution reconstructions critically depends upon robust background estimation. Scientific Reports. 4, 3854 (2014).
  28. Paintdakhi, A., et al. Oufti: An integrated software package for high-accuracy, high-throughput quantitative microscopy analysis. Molecular microbiology. 99 (4), 767-777 (2016).
  29. Rocha, J. M., Corbitt, J., Yan, T., Richardson, C., Gahlmann, A. Resolving Cytosolic Diffusive States in Bacteria by Single-Molecule Tracking. bioRxiv. , 483321 (2018).
  30. Lee, A., Tsekouras, K., Calderon, C., Bustamante, C., Presse, S. Unraveling the Thousand Word Picture: An Introduction to Super-Resolution Data Analysis. Chemical Reviews. 117 (11), 7276-7330 (2017).
  31. Los, G. V., et al. HaloTag: A Novel Protein Labeling Technology for Cell Imaging and Protein Analysis. ACS Chemical Biology. , (2008).
  32. Gautier, A., et al. An Engineered Protein Tag for Multiprotein Labeling in Living Cells. Chemistry & Biology. 15 (2), 128-136 (2008).
  33. Bisson-Filho, A. W., et al. Treadmilling by FtsZ filaments drives peptidoglycan synthesis and bacterial cell division. Science. 355 (6326), 739-743 (2017).
  34. Douglass, K. M., Sieben, C., Archetti, A., Lambert, A., Manley, S. Super-resolution imaging of multiple cells by optimised flat-field epi-illumination. Nature Photonics. 10 (11), 705-708 (2016).
  35. Zhao, Z., Xin, B., Li, L., Huang, Z. L. High-power homogeneous illumination for super-resolution localization microscopy with large field-of-view. Optics Express. 25 (12), 13382-13395 (2017).
  36. Yan, T., Richardson, C. J., Zhang, M., Gahlmann, A. Computational Correction of Spatially-Variant Optical Aberrations in 3D Single Molecule Localization Microscopy. bioRxiv. , 504712 (2018).
  37. Gahlmann, A., Moerner, W. E. Exploring bacterial cell biology with single-molecule tracking and super-resolution imaging. Nature Reviews Microbiology. 12 (1), 9-22 (2014).
  38. Liu, Z., Lavis, L. D., Betzig, E. Imaging live-cell dynamics and structure at the single-molecule level. Mol Cell. 58 (4), 644-659 (2015).
  39. Berglund, A. J. Statistics of camera-based single-particle tracking. Physical Review E. 82 (1), 011917 (2010).
  40. Parry, B. R., et al. The bacterial cytoplasm has glass-like properties and is fluidized by metabolic activity. Cell. 156 (1-2), 183-194 (2014).
  41. English, B. P., et al. Single-molecule investigations of the stringent response machinery in living bacterial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (31), E365-E373 (2011).
  42. Niu, L. L., Yu, J. Investigating intracellular dynamics of FtsZ cytoskeleton with photoactivation single-molecule tracking. Biophysical Journal. 95 (4), 2009-2016 (2008).
  43. Coquel, A. S., et al. Localization of protein aggregation in Escherichia coli is governed by diffusion and nucleoid macromolecular crowding effect. PLoS Computational Biology. 9 (4), e1003038 (2013).
  44. Nenninger, A., Mastroianni, G., Mullineaux, C. W. Size Dependence of Protein Diffusion in the Cytoplasm of Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 192 (18), 4535-4540 (2010).
  45. Dix, J. A., Verkman, A. S. Crowding effects on diffusion in solutions and cells. Annual Review of Biophysics. 37, 247-263 (2008).
  46. Elliott, L. C., Barhoum, M., Harris, J. M., Bohn, P. W. Trajectory analysis of single molecules exhibiting non-brownian motion. Physical Chemistry Chemical Physics. 13 (10), 4326-4334 (2011).

Tags

Single-molecule Tracking3D TrackingDiffusive StatesCytosolic MoleculesFluorescence MicroscopyAgarose PadYersinia EnterocoliticaCell VolumeZ-calibrationMATLABHCImage Live

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Rocha, J. M., Gahlmann, A. Single-Molecule Tracking Microscopy – A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules. J. Vis. Exp. (151), e59387, doi:10.3791/59387 (2019).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image