In Vitro Ubiquitination e Deubiquitination Saggi di Istoni Nucleosomici

L’ubiquitinazione è una delle modifiche post-traduzionali più conservate ed è fondamentale per un’ampia varietà di organismi, tra cui lievito, piante e vertebrati. L’ubiquitinazione consiste nell’attaccamento covalente dell’ubiquitina, un polipeptide da 76 amminoacidi altamente conservato, per colpire le proteine e si verifica in tre fasi sequenziali che coinvolgono tre enzimi, vale a dire, l’attivazione di E1, la coniugazione E2 e la ligase^{1: 2,3}. Questa modifica post-traduzionale svolge un ruolo centrale in un ampio spettro di processi biologici. Infatti, i legamenti E3, che forniscono la specificità della reazione, costituiscono una grande superfamiglia di enzimi e sono gli enzimi più abbondanti del sistema di ubiquitina^4,5,6. Gli effetti a valle dell’ubiquitinazione proteica dipendono dalla natura della modificazione: monoubiquitinazione, multimonoscanto e poliubiquitinazione lineare o ramificata. La monoubiquitinazione è raramente associata alla degradazione proteasomica, ma questa modifica è coinvolta nella mediazione di vari eventi di segnalazione. La poliubiquitinazione coinvolge i residui di lisina o di lisina nella molecola di ubiquitina stessa, e il destino di una proteina poliubificata dipende da quale residuo è coinvolto nell’estensione della catena di ubiquitina. È noto da tempo che la poliubiquitinazione mediata dalla lisina 48 dell’ubiquitina induce la degradazione proteasomica. Al contrario, la poliubiquitinazione via lisina 63 di ubiquitina è spesso associata all’attivazione della proteina^7,8,9. Simile ad altre importanti modifiche post-traduzionali, l’ubiquitinazione è reversibile e la rimozione dell’ubiquitina dalle proteine è garantita da proteasi specifici rivolte deubiquitinase (DUB), che sono emerse come importanti regolatori dei processi cellulari ^{2 Il} nome del sistema ^{, 10}. È importante sottolineare che molti DUB sono altamente specializzati e regolano, attraverso la deubiquitinazione, substrati specifici, indicando che un sottile equilibrio tra ubiquitazione e deubiquitinazione è fondamentale per la funzione proteica. Gli E3 e i DUB, insieme ai meccanismi proteasomeri di degradazione e ai fattori accessori, formano il sistema Ubiquitin Proteasome System (UPS, con geni >1200) che regola i principali percorsi di segnalazione, molti dei quali sono associati alla crescita cellulare e alla proliferazione, determinazione del destino cellulare, differenziazione, migrazione cellulare, e la morte delle cellule. È importante sottolineare che la deregolazione di diverse cascate di segnalazione che coinvolgono l’ubiquitazione promuove la tumoralgenesi e le malattie di neurodegenerazione^{5,11,12,13, 14}.

L’ubiquitazione svolge ruoli pervasivi nella biologia della cromatina e nei processi dipendenti dal DNA^15,16,17. Per esempio, la monoubiquitinazione dell’istono H2A sulla lisina 119 (qui dopo H2A K119ub) è una modifica fondamentale post-traduzionale coinvolta nella repressione trascrizionale e nella riparazione del DNA^{18,19,20, 21,22}. H2A K119ub è catalizzato dal Polycomb Repressive Complex 1 (PRC1), che svolge un ruolo chiave nel mantenimento delle informazioni epigenetiche ed è altamente conservato dalla Drosophila all’uomo. Canonical PRC1 è costituito in particolare dal RING1B e BMI1, che sono il complesso principale E3 ubiquitin ligase responsabile del suddetto evento di ubiquitinazione^22,23. In Drosophila, la monoubiquitinazione H2A (H2A K118ub che corrisponde a H2A K119ub nei mammiferi) è invertita dal DUB Calypso, che interagisce con Additional Sex Comb (ASX) formando il complesso DUB policomb-repressivo (PR-DUB)²⁴. L’ortologo mammifero di calypso, BAP1, è un soppressore tumorale cancellato o inattivato in varie neoplasie umane^{25,26,27,28, 29} del 22 221 ^{, 30} milio ^{, 31 Milia , 32 Milia} risse ^{, 33.}BAP1 regola i processi dipendenti dal DNA nel nucleo e l’apoptosi mediata dalla segnalazione del calcio al reticolo endoplasmico^{33,34,35,36, 37 Mi} lasa’ di ^{, 38 Mi} lasa ^{, 39 mila: l’altro , 40} anni ( ^{, 41} del sistema ^{, 42}. BAP1 assembla complessi proteici multi-subunità contenenti regolatori di trascrizione in particolare ASXL1, ASXL2 e ASXL3 (ASXL), tre ortologhi di ASX^38,43. Gli ASXL utilizzano il dominio DEUBiquitinase ADaptor (DEUBAD), anche chiamato dominio ASXM, per stimolare l’attività BAP1 DUB^35,36,44. Quindi, gli ASXL svolgono un ruolo importante nel coordinare l’attività di BAP1 DUB alla cromatina e più in generale la sua funzione di soppressore tumorale.

Esistono diversi metodi per studiare i processi di ubiquitinazione e deubiquitinazione. In particolare, i saggi biochimici che utilizzano proteine purificate dai batteri rimangono molto potenti nel dimostrare l’ubiquitinazione diretta o la rimozione dell’ubiquitina da substrati specifici. Questi esperimenti possono essere condotti per studiare una serie di parametri come la determinazione del requisito di complessi minimi, la determinazione della cinetica delle reazioni, la definizione delle relazioni struttura/funzione e la comprensione dell’impatto mutazioni genetiche. Qui, forniamo protocolli per condurre reazioni di ubiquitinazione e deubiquitinazione su substrati di cromatina con componenti purificati. Come sistema modello, viene presentata l’ubiquitinazione in vitro e la deubiquitinazione della proteina H2A nucleosomica. Le proteine purificate dai batteri assemblate in complessi minimi di RING1B/BMI1 e BAP1/DEUBAD vengono utilizzate rispettivamente per l’ubiquitinazione o la deubiquitinazione del nucleosomal H2A.