ケラチン生成細胞増殖の 2 次元と 3 次元の評価タイプ I コラーゲン基板

1. 表皮細胞培養培地の調製 注: は、無菌条件の下ですべての手順を実行します。 ペニシリン-ストレプトマイシンの K110 タイプ II 媒体 (K110) の 500 mL に添加サプリメント K-1 の 10 mL のピペットを使用して 5 mL を追加します。 2. 線維状の準備 I 型コラーゲン 注: は、無菌条件下でステップ 2.6 までの手順を実行します。 リン酸緩衝生理食塩水 (PBS (-))、脱イオン水、コラーゲン、96-well 培養プレート、氷の上の空の 2 mL チューブ × 10 を維持します。注: 線維と非線維性フォームを準備するのに同じプレートを使用しないでください。 ピペットを使用して空の 2 mL チューブに 1.12 mL の脱イオン水を追加します。ピペットを使用して 2 mL チューブに脱イオン水に 200 μ L の 10 x PBS (-) を追加します。数回チューブを軽く振る。 コラーゲンの 0.66 mL をピペットを使用して 2 mL チューブに追加します。慎重かつ迅速には、チューブを数回振る。注: は、気泡の可能な限りのソリューションを避けてください。使用する前にすぐにコラーゲン溶液を準備します。 96 ウェル培養プレートの各ウェルにステップ 2.3 からコラーゲン溶液 100 μ L を注ぐ。左右の動きからの培養プレートを軽く振る。注: は、コラーゲン溶液と井戸の表面全体をカバーします。ソリューションが表面全体をカバーしていない場合は、ピペット チップを使用して、ソリューションを普及します。気泡の可能な限りのソリューションを避けてください。 CO2のインキュベーターで培養プレートを配置し、, 1 h. チェック コラーゲンのゲル化の 37 ° C で培養プレートをクリーン ベンチに移動します。注: は、培養プレートを傾けることによってゲル化を確認します。 場所文化 CO2インキュベーターでプレートし、, 1 h. クリーン ベンチへの培養プレートの 37 ° C で、井戸の壁に沿ってピペットを使用してゲルの K110 の 150 μ L をそっと注ぐ。細胞培養の前にそっと破棄、K110 ピペットを使用しています。注: ゲルを保護するためにピペットの先端は井戸の壁をタッチする必要があります。 3. 非繊維状の準備 I 型コラーゲン 注: は、無菌条件の下ですべての手順を実行します。 1.2 mL 1 mM 塩酸 (HCl) 1.5 mL チューブにコラーゲンの 4 μ L を追加し、ピペットを使用して軽く混ぜます。注: 使用する前にすぐにコラーゲンを準備します。コラーゲンを保ち、使用時まで冷蔵して HCl。 ピペットを使用して 96 ウェル培養プレートの各ウェルに 100 μ L のコラーゲンを注ぐ。運動し 1 時間室温で孵化させなさい左の培養プレートを軽く振る。注: は、井戸の表面全体がソリューションで覆われていることを確認します。 、孵化後コラーゲン液を捨て、PBS (-) 2 回ピペットを使用しての洗浄します。 1% ウシ血清アルブミン/PBS (-) (1 %bsa) 96 ウェル培養プレートの井戸までの 150 μ L を注ぐと細胞培養の前に 1 時間室温で孵化させなさい、1 %bsa を破棄します。注: は、井戸の表面全体がソリューションで覆われていることを確認します。 4. FEPE1L 8 細胞の培養 注: は、無菌条件の下ですべての手順を実行します。 100 mm の K110 で FEPE1L 8 セル CO2インキュベーターで皿を文化し、37 ° C、5% CO2、半合流で維持します。 K110、トリプシン、トリプシン ・ インヒビターの 37 ° C の水浴中準備します。 慎重に培養皿からメディアを取り出して、ピペットを使用して 0.05% トリプシンの 3 mL を加える、CO2インキュベーターに皿を置き、5 分の 37 ° C で孵化させなさい。インキュベーション後、10 倍の倍率で位相差顕微鏡を用いた培養皿の表面の細胞の剥離を確認します。注: 独立した細胞の形態になるラウンド。細胞が広がっている場合は、5 分の追加期間インキュベートします。 トリプシン ・ インヒビターの 3 mL を追加し、ピペットを使用して 15 mL 遠心管中の剥離細胞を収集します。5 分間 200 x g で 15 mL 遠心管の細胞を遠心します。 上澄みを廃棄し、再 K110 の 10 mL のピペットを使用してにペレットを中断します。10 倍の倍率で位相差顕微鏡を使用してセルをカウントし、K110 適切な希釈による細胞濃度 5.0 x 104セル/mL を準備します。 優しく K110 井戸の壁に沿ってピペットを使用して培養プレートの各ウェルに細胞を 0.1 mL をシードします。CO2インキュベーターで培養プレートを置き、37 ° C で示された時間 (2 時間、1 日、3 日) 孵化させなさい。注: ゲルを保護するためにピペットの先端は井戸の壁をタッチする必要があります。 5. 生菌数の推定 K110 37 ° C の水浴中に孵化させなさいテトラゾリウム塩、2-(2-methoxy-4-nitrophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2Hテトラゾリウム、ナトリウム塩 (WST-8)、K110 の 1.3 mL をピペット 2 mL チューブにミックス 130 μ L。 培養プレートをクリーン ベンチに移動し、優しく破棄、K110 ピペットを使用しています。優しく洗い流す K110 と非付着性のセル ピペットを使用して よくピペットを使用して各 WST 8 混ぜ K110 の 110 μ L を追加、CO2インキュベーターで培養プレートを配置、37 ° C 2 時間で孵化させなさい。 培養プレートをクリーン ベンチに移動、各ウェルから馴化培地の 100 μ L を収集し、別の 96 ウェル培養プレートのウェルに移動します。450 の波長で吸光度を測定 nm (外径450) マイクロ プレート リーダーおよび実行可能なセルの数の見積もりを使用しています。