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生物工程

Eine automatisierte Methode zur Durchführung des In-Vitro-Mikrokern-Assays mit multispektraler Bildflusszytometrie

Published: May 13, 2019
doi:
10.3791/59324
1Biology Department,Luminex Corporation

Summary

Der In-vitro-Mikrokern-Assay ist eine etablierte Methode zur Bewertung von Genotoxizität und Zytotoxizität, aber die Bewertung des Assays mittels manueller Mikroskopie ist mühsam und leidet unter Subjektivität und Inter-Scorer-Variabilität. In diesem Artikel wird das Protokoll beschrieben, das entwickelt wurde, um eine vollautomatische Version des Tests mit multispektraler Bildflusszytometrie durchzuführen.

Abstract

Der In-vitro-Mikrokern (MN)-Assay wird häufig zur Bewertung der Zytotoxizität und Genotoxizität verwendet, aber die Bewertung des Assays mittels manueller Mikroskopie ist mühsam und führt zu Unsicherheit in den Ergebnissen aufgrund der Variabilität zwischen den Scorern. Um dies zu beheben, wurden automatisierte Dia-Scanning-Mikroskopie sowie herkömmliche Durchflusszytometrie-Methoden eingeführt, um die Voreingenommenheit des Scorerzufalls zu beseitigen und den Durchsatz zu verbessern. Diese Methoden haben jedoch ihre eigenen inhärenten Einschränkungen, wie z. B. die Unfähigkeit, das Zytoplasma der Zelle zu visualisieren und das Fehlen einer visuellen MN-Verifizierung oder Bilddatenspeicherung mit Durchflusszytometrie. Multispektrale Imaging Flow Cytometry (MIFC) hat das Potenzial, diese Einschränkungen zu überwinden. MIFC kombiniert die hochauflösenden fluoreszierenden Bilder der Mikroskopie mit der statistischen Robustheit und Geschwindigkeit der konventionellen Durchflusszytometrie. Darüber hinaus können alle gesammelten Bilder in dosisspezifischen Dateien gespeichert werden. In diesem Artikel wird das Protokoll beschrieben, das entwickelt wurde, um eine vollautomatische Version des MN-Tests auf MIFC durchzuführen. Die tK6-Zellen des menschlichen Lymphoblastoids wurden mit einer hypotonischen Lösung (75 mM KCl) vergrößert, die mit 4% Formalin fixiert wurde, und der Kerngehalt wurde mit Hoechst 33342 gefärbt. Alle Proben wurden in Suspension auf der MIFC ausgeführt, was die Erfassung von hochauflösenden Bildern aller für den Test erforderlichen Schlüsselereignisse (z. B. binukleierte Zellen mit und ohne MN sowie mononukleierte und polynukleierte Zellen) ermöglichte. Bilder wurden automatisch in der MIFC-Datenanalysesoftware identifiziert, kategorisiert und aufgezählt, was eine automatisierte Bewertung sowohl der Zytotoxizität als auch der Genotoxizität ermöglicht. Die Ergebnisse zeigen, dass die Verwendung von MIFC zur Durchführung des In-vitro-MN-Assays es ermöglicht, statistisch signifikante Erhöhungen der MN-Frequenz in verschiedenen Zytotoxizitätsstufen im Vergleich zu Lösungsmittelkontrollen nach Exposition von TK6-Zellen Mitomycin C und Colchicin, und dass keine signifikanten Anstiegder der MN-Frequenz nach Exposition gegenüber Mannitol beobachtet werden.

Introduction

Der In-vitro-Mikrokern (MN)-Assay ist ein häufig verwendeter Test zur Beurteilung der Zytotoxizität und Genotoxizität als Screening-Tool in verschiedenen Studienbereichen wie der chemischen und pharmazeutischen Entwicklung sowie dem humanen Biomonitoring bei Personen, die verschiedenen Umwelt-, Berufs- oder Lebensstilfaktoren1,2,3. MN bestehen aus Chromosomenfragmenten oder ganzen Chromosomen, die während der Zellteilung erzeugt werden und nicht in eine der beiden Haupttochterkerne integriert sind. Nach der Telophase bildet sich dieses chromosomale Material zu einem individuellen, abgerundeten Körper innerhalb des Zytoplasmas, der von einem der Hauptkerne2getrennt ist. Daher sind MN repräsentativ für DNA-Schäden und werden seit vielen Jahrenals Endpunkt in Genotoxizitätstests 4 verwendet. Die am besten geeignete Methode zur Messung von MN ist der Cytokinese-Block-Mikrokern (CBMN)-Assay. Mit dem CBMN-Test kann die Häufigkeit von MN in binucleatierten Zellen (BNCs) durch Die Einbeziehung von Cytochalasin B (Cyt-B) in die Probe bewertet werden. Cyt-B erlaubt die nukleare Teilung, verhindert aber die zelluläre Teilung und beschränkt somit die Bewertung von MN auf BNCs, die nur einmal5geteilt haben.

Protokolle, die sowohl Mikroskopie als auch Durchflusszytometrie verwenden, wurden entwickelt und validiert und werden routinemäßig zur Durchführung des In-vitro-MN-Assays6,7,8,9,10, 11,12,13,14. Mikroskopie profitiert davon, dass sie visuell bestätigen kann, dass MN legitim ist, aber zeitaufwändig und anfällig für Variabilität zwischen den Scorern15ist. Um diesem Problem zu begegnen, wurden automatisierte Mikroskopiemethoden entwickelt, um Dias zu scannen und Bilder von Kernen und MN16,17,18,19, aufzunehmen, aber das Zytoplasma kann nicht visualisiert werden, so dass es schwer zu bestimmen, ob eine MN tatsächlich einer bestimmten Zelle zugeordnet ist. Darüber hinaus haben diese Methoden Schwierigkeiten, polynukleierte (POLY) Zellen (einschließlich tri- und quadranukleatierte Zellen) zu identifizieren, die für die Berechnung der Zytotoxizität bei der Verwendung von Cyt-B9erforderlich sind. Durchflusszytometriemethoden, die zur Durchführung des MN-Assays entwickelt wurden, verwenden Fluoreszenz sowie Vorwärts- und Seitenstreuintensitäten, um Populationen sowohl der Kerne als auch der MN zu identifizieren, die nach der Lyse20,21 aus der Zelle befreit wurden. ,22. Dies ermöglicht die Erfassung von Daten aus mehreren tausend Zellen in wenigen Minuten und ermöglicht eine automatisierte Analyse23; Die Unfähigkeit, die Zellen zu visualisieren, macht es jedoch unmöglich zu bestätigen, dass gewertete Ereignisse echt sind. Darüber hinaus hemmt das Lysing der Zellmembran die Verwendung von Cyt-B und schafft eine Suspension, die andere Ablagerungen wie Chromosomenaggregate oder apoptotische Körper enthält, und es gibt keine Möglichkeit, diese von MN24zu unterscheiden.

Angesichts dieser Einschränkungen ist Multispektrale Imaging Flow Cytometry (MIFC) ein ideales System für die Durchführung des MN-Assays, da es die hochauflösenden fluoreszierenden Bilder der Mikroskopie mit der statistischen Robustheit und Geschwindigkeit der konventionellen Durchflusszytometrie kombiniert. In MIFC werden alle Zellen in ein Fluidiksystem eingeführt und dann hydrodynamisch in das Zentrum einer Durchflusszellküvetette fokussiert. Die orthogonale Ausleuchtung aller Zellen erfolgt durch den Einsatz einer Hellfeld-Leuchtdiode (BF), einer seitlichen Streuungslaser und (mindestens) eines Fluoreszenzlasers. Fluoreszierende Photonen werden von einer von drei (20x, 40x oder 60x) hohen numerischen Blendenobjektiven erfasst und durchlaufen dann ein spektrales Zersetzungselement. Photonen werden dann auf eine aufgeladene Gerätekamera (CCD) fokussiert, um hochauflösende Bilder aller Zellen zu erhalten, die die Durchflusszelle passieren. Um Unschärfen oder Streifen zu vermeiden, arbeitet die CCD im TDI-Modus (Time Delay Integration), der Objekte verfolgt, indem sie Pixelinhalte von Zeile zu Zeile nach unten überträgt. Pixelinformationen werden dann aus der letzten Pixelzeile gesammelt. Tdi-Bildgebung in Kombination mit spektraler Zersetzung ermöglicht es, bis zu 12 Bilder (2 BF, 10 fluoreszierend) gleichzeitig von allen Zellen, die die Durchflusszelle passieren, zu erfassen. Alle erfassten Bilder werden in beispielspezifischen Datendateien gespeichert, so dass die Analyse jederzeit mit der MIFC-Datenanalysesoftware durchgeführt werden kann. Schließlich behalten Datendateien die Verbindung zwischen Zellbildern und Punkten in allen bivariaten Diagrammen bei. Dies bedeutet, dass jeder Punkt auf einem traditionellen bivariaten Diagramm hervorgehoben werden kann und die entsprechenden BF- und Fluoreszenzbilder25angezeigt werden.

Kürzlich wurden MIFC-basierte Methoden entwickelt, um den MN-Assay für die Triage-Strahlungsbiodosimetrie26,27,28,29,30,31 und genetische Toxikologie32,33 Tests. Diese Arbeit hat gezeigt, dass Zellbilder von Hauptkernen, MN und dem Zytoplasma mit einem höheren Durchsatz als andere Methoden abgebildet werden können26. Alle für die Analyse erforderlichen Zelltypen, einschließlich MONO-Zellen, BNCs (mit und ohne MN) und POLY-Zellen, können automatisch in der MIFC-Datenanalysesoftware identifiziert werden, und die Umsetzung der von Fenech et al. entwickelten Bewertungskriterien wird durch die Verwendung verschiedener mathematischer Algorithmen6,34. Die Ergebnisse der Biodosimetrie zeigten, dass die Dosis-Wirkungs-Kalibrierungskurven in der Größenordnung denen anderer automatisierter Methoden in der Literatur bei der Quantifizierung der MN-Rate pro BNC29ähnlich waren. Darüber hinaus haben jüngste Arbeiten in der Toxikologie gezeigt, dass Bilder von MONO-Zellen, BNCs (mit und ohne MN) und POLY-Zellen automatisch mit MIFC erfasst, identifiziert, klassifiziert und aufgezählt werden können. Die Protokoll- und Datenanalyse ermöglichte die Berechnung der Zytotoxizität und Genotoxizität, nachdem TK6-Zellen mehreren Clastogenen und Aneugenen32aussetzten.

Das in diesem Dokument vorgestellte Protokoll beschreibt eine Methode zur Durchführung des In-vitro-MN-Assays mit MIFC. Die bei dieser Arbeit verwendete Probenverarbeitungstechnik benötigt weniger als 2 h, um eine einzelne Probe zu verarbeiten, und ist im Vergleich zu anderen Methoden relativ einfach durchzuführen. Die Datenanalyse in der MIFC-Analysesoftware ist kompliziert, aber die Erstellung der Analysevorlage kann in wenigen Stunden nach den in diesem Dokument beschriebenen Schritten durchgeführt werden. Darüber hinaus kann die Vorlage, sobald sie erstellt wurde, ohne weitere Arbeit automatisch auf alle gesammelten Daten angewendet werden. Das Protokoll beschreibt alle Schritte, die erforderlich sind, um TK6-Zellen Clastogenen und Aneugenen auszusetzen, beschreibt, wie die Zellen kultiviert, verarbeitet und befleckt werden, und zeigt, wie man hochauflösende Bilder mithilfe von MIFC erfasst. Darüber hinaus veranschaulicht dieses Papier die aktuellen Best Practices für die Analyse von Daten in MIFC-Software zur automatischen Identifizierung und Bewertung von MONO-Zellen, BNCs und POLY-Zellen zum Zwecke der Berechnung von Zytotoxizität und Genotoxizität.

Protocol

1. Vorbereitung des Kulturmediums und Kultivierung von TK6-Zellen HINWEIS: Einige Chemikalien, die in diesem Protokoll verwendet werden, sind giftig. Das Einatmen, Schlucken oder Kontaktieren der Haut mit Cytochalasin B kann tödlich sein. Tragen Sie geeignete persönliche Schutzausrüstung, einschließlich eines Labormantels und zwei Paar Nitrilhandschuhe. Waschen Sie die Hände gründlich nach der Handhabung. Formalin/Formaldehyd ist toxisch, wenn es eingeatmet oder verschluckt wird; ist reizend für die Augen, Atemwege, und Haut; sensibilisierung durch Inhalation oder Hautkontakt. Es besteht die Gefahr einer schweren Schädigung der Augen. Es ist ein potenzielles Karzinogen. Bereiten Sie 565 ml 1x RPMI Kulturmedium vor. Fügen Sie 5 ml MEM nicht-essentielle Aminosäuren (100x), 5 ml Natriumpyruvat (100 mM), 5 ml Penicillin-Streptomycin-Glutamin (100x) und 50 ml fetales Rinderserum (FBS) zu einer 500 ml Flasche mit 1x RPMI 1640 Medium hinzu. Bereiten Sie das Medium in einem Biosicherheitsschrank vor und lagern Sie es bei 2-8 °C. Erhitzen Sie das Medium auf 37 °C, bevor Sie es den TK6-Zellen hinzufügen (siehe Materialtabelle). 1 ml TK6-Zellen (bei -80 °C in DMSO) in 10 ml Medium auftauen. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 200 x g für 8 min und aspirieren Sie den Überstand. Die Zellen auf 50 ml Medien übertragen und bei 37 °C, 5%CO2inkubieren. Die Verdoppelungszeit der TK6-Zellen variiert zwischen 12-18 h und einige (3 oder 4) Passagen werden benötigt, damit die Zellen ihre maximale Proliferationsrate erreichen (siehe Tabelle der Materialien). Kultur 100 ml der Zellen zu einer Konzentration von 7-8 x 105 Zellen/ml. 2. Herstellung von Clastogenen und/oder Aneugenen und Cytochalasin B Bereiten Sie geeignete Lagerkonzentrationen von gewünschten Clastogenen und Aneugenen vor. Zum Beispiel, für Mitomycin C, lösen Sie eine volle 2 mg Flasche in 10 ml sterilem Wasser, um eine endgültige Lagerkonzentration von 200 g/ml zu erreichen. Mitomycin C kann drei Monate lang bei 4 °C gelagert werden (siehe Materialtabelle). Bereiten Sie am Experimenttag Verdünnungen der gewünschten Chemikalien vor, die entweder 10-fach oder 100-fach höher als die gewünschten Expositionskonzentrationen sind, wenn sie in sterilem Wasser bzw. DMSO verdünnt werden. Für Mitomycin C 3 ml Verdünnungen in sterilem Wasser von 0,5, 1,0, 2,0, 3,0, 4,0 und 5,0 g/ml zubereiten. Für Colchicin 3 ml Verdünnungen in sterilem Wasser von 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4 und 0,5 g/ml zubereiten. Schließlich, für Mannitol, bereiten 3 ml Verdünnungen in sterilem Wasser von 5, 10, 20, 30, 40, und 50 mg/ml. Bereiten Sie eine Lagerkonzentration von Cytochalasin B von 200 g/ml vor, indem Sie eine 5 mg-Flasche in 25 ml DMSO auflösen. Cytochalasin B kann mehrere Monate bei -20 °C gelagert werden. 3. Exposition von Zellen gegenüber Clastogenen und/oder Aneugenen Fügen Sie 1 ml gewünschte Chemikalie (z. B. Mitomycin C) zu 9 ml Zellen bei 7-8×105 Zellen/ml in einem T25-Kolben hinzu. Für die Kontrollproben 1 ml steriles Wasser hinzufügen. Legen Sie die Kolben in einen 37 °C, 5% CO2-Inkubator für 3 h.HINWEIS: Wenn Chemikalien in DMSO verdünnt werden, fügen Sie nur 100 l der Chemikalie zu jedem Kolben hinzu und fügen Sie den Kontrollen 100 l DMSO hinzu. Jeder Kolben sollte 9.900 ml Zellen enthalten. Nach 3 h Kolben aus dem Inkubator entfernen und Zellen in 15 ml Polypropylenrohre übertragen. Zentrifugieren Sie bei 200 x g für 8 min, aspirieren Sie den Überstand und übertragen Sie Zellen auf neue T25-Flaschen, die insgesamt 10 ml frisches Kulturmedium enthalten. Fügen Sie jedem Kolben 150 l der Lagerkonzentration (200 g/ml) von Cytochalasin B hinzu, um eine Endkonzentration von 3 g/ml zu erreichen. Geben Sie die Kolben in den 37 °C, 5% CO2-Inkubator für eine Erholungszeit gleich 1,5-2,0 Verdoppelungszeiten zurück, wie in den OECD-Leitlinien9empfohlen. Für die bei dieser Arbeit verwendeten TK6-Zellen betrug die Wiederherstellungszeit 24 h.HINWEIS: Die Verdoppelungszeit der hier verwendeten TK6-Zellen betrug 15 h und eine Erholungszeit von 24 h (1,6 Verdoppelungszeiten) wurde verwendet. Die Regenerationszeiten von weniger als 1,5 Verdoppelungen reduzieren die Proliferation in Proben, die höheren Dosen ausgesetzt sind, die die Anzahl der BNCs beeinflussen. Umgekehrt werden Erholungszeiten von mehr als 2,0 eine unverhältnismäßige Anzahl polynukleierter Zellen in Kontrollproben produzieren. Zytotoxizitätsberechnungen. 4. Erstellung von Puffern zur Fixierung und Kennzeichnung des DNA-Gehalts (siehe Materialtabelle) 75 mM Kaliumchlorid (KCl) vorbereiten, indem Man 2,79 g zu 500 ml Reinstwasser hinzufügt. Rühren Sie die Lösung für 5 min mit einem magnetischen Rührer und sterilen Filter durch einen 200-m-Filter. Die 75 mM KCl Lösung kann mehrere Monate bei 4 °C gelagert werden. Bereiten Sie eine ausreichende Menge von 4% Formalin für das Experiment vor, in der Erwartung, dass jeder Probe insgesamt 2,1 ml hinzugefügt werden müssen. Um beispielsweise 10 ml 4% Formalin vorzubereiten, fügen Sie 4 ml 10% Formalin-Bestand zu 6 ml der 1x Phosphat-gepufferten Saline-Lösung von Dulbecco ohne Ca2+ oder Mg2+ (PBS) hinzu. Dieses 4% Formalin kann bei Raumtemperatur für mehrere Wochen gelagert werden. Bereiten Sie 510 ml Waschpuffer (2% FBS in 1X PBS) vor, indem Sie 10 ml FBS zu einer 500 ml Flasche 1x PBS hinzufügen. Bereiten Sie 10 ml einer Konzentration von 100 g/ml von Hoechst 33342 vor, indem Sie 100 l der Lagerkonzentration (1 mg/ml) auf 9.900 l 1X PBS addiert. Die Lösung Hoechst 33342 kann mehrere Monate bei 4 °C gelagert werden. 5. Probenverarbeitung: hypotonische Schwellung, Fixierung, Zellzählung und Kennzeichnung des DNA-Gehalts Am Ende der Erholungsphase alle Kolben aus dem Inkubator entfernen und alle Proben in 15 ml Polypropylenrohre übertragen. Zentrifugieren Sie alle Proben bei 200 x g für 8 min. Den Überstand ansaugen, die Zellen wieder aufhängen und 5 ml 75 mM KCl hinzufügen. Dreimal durch Inversion sanft mischen und bei 4 °C 7 min inkubieren. Fügen Sie 2 ml 4% Formalin zu jeder Probe hinzu, mischen Sie vorsichtig durch Inversion dreimal und inkubieren bei 4 °C für 10 min. Dieser Schritt fungiert als “weiche Fixierung”. Zentrifugieren Sie alle Proben bei 200 x g für 8 min. Den Überstand ansaugen und in 100 l von 4% Formalin für 20 min resuspendieren. Dieser Schritt wirkt wie eine “harte Fixierung”. 5 ml Waschpuffer und Zentrifuge bei 200 x g für 8 min hinzufügen. Den Überstand ansaugen und in 100 l Waschpuffer wieder aufsetzen. Übertragen Sie alle Proben in 1,5 ml Mikrozentrifugenrohre. Führen Sie für jede Probe eine Zellanzahl aus, um die Anzahl der Zellen pro Probe zu bestimmen. Die Proben werden hochkonzentriert sein, so dass eine 1:100-Verdünnung in 1x PBS (10 l der Probe in 990 l PBS) wahrscheinlich erforderlich sein wird, um eine genaue Anzahl zu erhalten.HINWEIS: An dieser Stelle ist es am besten, Zellzählungen mit einem Hämozytometer durchzuführen. Das Hinzufügen von KCl verleiht dem Zytoplasma ein transluzentes Erscheinungsbild, was es für automatisierte Zellzähler schwierig macht, sie zu erkennen. Auch automatisierte Zähler haben aufgrund ihrer Größe Schwierigkeiten, polynukleierte Zellen zu punkten. Wenn die Proben nicht sofort auf der MIFC ausgeführt werden, können sie mehrere Tage bei 4 °C gelagert werden. Wenn Sie mit der Ausführung von Proben bereit sind, fügen Sie jeder Probe 5 l von 100 g/ml pro 1×106 Zellen/ml hinzu. Fügen Sie auch 10 l von 500 g/ml RNase pro 100 l Probe für eine Endkonzentration von 50 g/ml hinzu. Inkubieren Sie die Proben bei 37 °C, 5% CO2 für 30 min. Mikrozentrifugieren Sie alle Proben bei 200 x g für 8 min und verwenden Sie eine Pipette, um den Überstand zu entfernen, der 30 l beträgt. Verwenden Sie eine Pipette, um alle Proben wieder auszusetzen, bevor Sie auf der MIFC ausgeführt werden, um sicherzustellen, dass sich keine Blasen im Rohr befinden. Wirbel nicht. 6. Starten und Kalibrieren der MIFC Stellen Sie sicher, dass die Mantel-, Systemkalibrierungsreagenz, Debubbler, Reinigungs- und Sterilisatorbehälter voll sind und der Abfallbehälter leer ist. Schalten Sie das System ein, und doppelklicken Sie auf das SYMBOL der MIFC-Software. Klicken Sie auf die Schaltfläche Start, und stellen Sie sicher, dass das Kontrollkästchen Alle Kalibrierungen und Tests starten aktiviert ist. Dadurch werden die Reagenzien für system-, Lastmantel- und Systemkalibrierungsmittel gespült und das System kalibriert (siehe Tabelle der Materialien). 7. Ausführen von Beispielen auf der MIFC HINWEIS: In diesem Abschnitt wird die Verwendung einer MIFC mit 2 Kameras vorausgesetzt. Wenn Sie eine 1 Kamera MIFC verwenden, lesen Sie bitte Supplement 1 – Full Protocol, Abschnitt 7 für die Erstellung von Plots während der Erfassung Starten Sie die MIFC-Datenerfassungssoftware (siehe Tabelle der Materialien). Abbildung 1 zeigt die Geräteeinstellungen. Schalten Sie den 405 nm Laser ein und stellen Sie die Laserleistung auf 10 mW (A )ein. Deaktivieren Sie alle anderen Laser (einschließlich SSC) und stellen Sie die BF auf die Kanäle 1 und 9 (B). Vergewissern Sie sich, dass der Vergrößerungsregler auf 60x (C) eingestellt ist, der Hochempfindlichkeitsmodus ausgewählt ist (D), und dass nur die Kanäle 1, 7 und 9 in der Bildergalerie angezeigt werden. Klicken Sie auf das Scatterplot-Symbol. Wählen Sie die Gesamtpopulation aus, und wählen Sie Bereich M01 auf der X-Achse und das Seitenverhältnis M01 auf der Y-Achse aus. Klicken Sie auf das Symbol Quadratregion und zeichnen Sie einen Bereich um die einzelnen Zellen. Benennen Sie diesen Bereich Single Cells. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das Diagramm und wählen Sie Regionenaus. Markieren Sie den Bereich Einzelzellen, und ändern Sie die x-Koordinaten in 100 und 900, und ändern Sie die y-Koordinaten in 0,75 und 1 (Abbildung 1I). Klicken Sie auf das Scatterplot-Symbol. Wählen Sie Einzelne Zellen als übergeordnete Grundgesamtheit aus, wählen Sie Gradient RMS M01 auf der X-Achse und Gradient RMS M07 auf der Y-Achse aus. Klicken Sie auf das Symbol Quadratregion und zeichnen Sie einen Bereich um die meisten Zellen. Benennen Sie diesen Bereich Fokussierte Zellen. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das Diagramm und wählen Sie Regionenaus. Markieren Sie den Bereich Fokussierte Zellen, und ändern Sie die x-Koordinaten in 55 und 75, und ändern Sie die y-Koordinaten in 9,5 und 20 (Abbildung 1J). Klicken Sie auf das Histogramm-Symbol. Wählen Sie die Population fokussierte Zellen aus, und wählen Sie Intensität M07 als Feature aus. Klicken Sie auf das Symbol Linearer Bereich, und zeichnen Sie eine Region über den Hauptgipfel im Histogramm. Nennen Sie diese Region DNA-positiv. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das Diagramm und wählen Sie Regionenaus. Markieren Sie den DNA-positiven Bereich und ändern Sie die Koordinaten auf 2 x 105 und 2 x 106. Der Bereich muss möglicherweise abhängig von der Intensitätsspitze des Histogramms angepasst werden (Abbildung 1K). Stellen Sie die Erfassungsparameter ein (Abbildung 1E). Geben Sie den Dateinamen und den Zielordner an, ändern Sie die Anzahl der Ereignisse auf 20.000, und wählen Sie die DNA-positive Grundgesamtheit aus. Klicken Sie auf Laden (Abbildung 1F), und platzieren Sie das Steuerelementbeispiel in der MIFC. Klicken Sie auf die Schaltfläche Acquire, um die Daten zu erfassen (Abbildung 1G). Sobald die Erfassung abgeschlossen ist, klicken Sie auf die Schaltfläche Zurück, um das Beispiel zurückzugeben (Abbildung 1H). Entfernen Sie das Probenrohr aus dem Gerät. Wiederholen Sie diesen Vorgang für alle verbleibenden Proben im Experiment. 8. Öffnen einer Datendatei in IDEAS Starten Sie das MIFC-Analysesoftwarepaket (siehe Tabelle der Materialien). Klicken Sie auf Analyse starten, um den Assistenten zum Öffnen von Dateienzu starten. Wählen Sie eine Datendatei aus, indem Sie zur gewünschten Rohbilddatei (.rif) navigieren. Klicken Sie auf die Schaltfläche Öffnen und auf Weiter. Da es sich um einen einzelnen Farbtest handelt, ist eine Kompensation nicht erforderlich, daher klicken Sie auf Weiter, um den Kompensationsschritt zu umgehen. In diesem Stadium gibt es keine Analysevorlage anzuwenden, daher klicken Sie erneut auf Weiter. Wenn die Analysevorlage aus dem Zusatzmaterial heruntergeladen wurde, wählen Sie sie jetzt aus. Diese Vorlagen funktionieren nur mit einer 2 Kamera MIFC mit BF auf Kanäle 1 und 9 und Kernbilder in Kanal 7 während der Erfassung eingestellt. Standardmäßig werden die Dateinamen .cif und .daf automatisch generiert, um mit der .rif zu entsprechen. Es wird nicht empfohlen, die Namen von .cif und .daf zuändern. Klicken Sie auf Weiter. Legen Sie die Bildanzeigeeigenschaften fest, indem Sie die Zeichen 01 und 07auswählen. Klicken Sie auf Weiter. Es gibt keinen Assistenten für diese Anwendung, daher klicken Sie auf Fertig stellen. Es ist sehr wichtig, die Datenanalysedatei (.daf) und die Analysevorlage (.ast) häufig in den Abschnitten 9–14 zu speichern, um Fortschrittsverluste zu vermeiden. 9. Erstellen von Masken und Funktionen zum Identifizieren von BNCs Klicken Sie auf das Symbol “Eigenschaften der Bildergalerie” (blau/weiß). Klicken Sie auf der Registerkarte Eigenschaften anzeigen auf Bereich auf Pixeldaten festlegen, und ändern Sie dann die Farbe in Gelb. Klicken Sie auf OK. Hoechst-Bilder sind jetzt leichter vor dem schwarzen Hintergrund zu sehen. Erstellen Sie das Diagramm der nicht-apoptotischen Zellen. Klicken Sie auf die Registerkarte Analyse und dann auf Masken. Klicken Sie auf Neu und dann auf Funktion. Wählen Sie unter Funktion Schwellenwertaus, wählen Sie unter Maske M07 und legen Sie den Intensitätsprozentsatz auf 50 fest. Klicken Sie auf OK und dann wieder auf OK. Klicken Sie auf Schließen. Klicken Sie auf die Registerkarte Analyse, klicken Sie auf Features, und klicken Sie dann auf Neu. Wählen Sie für den Feature-Typ Bereichaus. Wählen Sie für Maske den Schwellenwert (M07,Ch07,50)aus. Klicken Sie auf Standardname festlegen, und klicken Sie auf OK. Klicken Sie auf Schließen, um mit der Berechnung der Feature-Werte zu beginnen. Klicken Sie auf das Dot Plot-Symbol. Wählen Sie die Gesamtpopulation aus. Wählen Sie für das X-Achsen-Feature das Feature Contrast_M01_Ch01 und für das Y-Achsen-Feature Area_Threshold(M07,Ch07,50)aus. Klicken Sie auf OK. Klicken Sie auf die Schaltfläche Quadratregion, und zeichnen Sie einen Bereich um die meisten Zellen. Nennen Sie diese Region Non-apoptotic. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das Diagramm und klicken Sie auf Regionen. Markieren Sie die nicht-apoptotische Region. Legen Sie die x-Koordinaten auf 0 und 15 fest und legen Sie die y-Koordinaten auf 50 und 300 fest. Klicken Sie auf Schließen. Erstellen Sie die BNC-Maske (Schritte 9.3.1-9.3.5), um Zellen zu identifizieren, die nur zwei Kerne enthalten. Suchen Sie in der Bildergalerie nach einem BNC und klicken Sie darauf. Damit soll die Erstellung der Maske im Hoechst-Kanal visualisiert werden. Klicken Sie auf die Registerkarte Analyse und dann auf Masken. Klicken Sie auf Neu und dann auf Funktion. Wählen Sie unter Funktion LevelSetaus, wählen Sie unter Maske M07, wählen Sie die Optionsfeld maske mittlere Ebene aus, und legen Sie die Konturdetailskala auf 3.00 fest. Klicken Sie auf OK und dann wieder auf OK. Klicken Sie auf Neu und dann auf Funktion. Wählen Sie unter Funktion, Wählen Sie Dilateaus , und wählen Sie unter Maske LevelSet(M07,Ch07,Middle,3)aus. Legen Sie das anzuzeigende Bild auf Ch07fest, und legen Sie die Anzahl der Pixel auf 2 fest. Klicken Sie auf OK und dann wieder auf OK. Klicken Sie auf Neu und dann auf Funktion. Unter Funktion wählen Sie Wasserscheide, und wählen Sie unter Maske Dilate(LevelSet(M07,Ch07,Middle,3)2). Legen Sie das anzuzeigende Bild auf Ch07fest, und legen Sie die Linienstärke auf 1 fest. Klicken Sie auf OK und dann wieder auf OK. Klicken Sie auf Neu und dann auf Funktion. Unter Funktion wählen Sie Bereich, unter Maske wählen Sie Watershed(Dilate(LevelSet(M07,Ch07,Middle,3)2)). Legen Sie das anzuzeigende Bild auf Ch07fest. Legen Sie die minimalen und maximalen Flächenwerte auf 115 bzw. 5000 fest. Legen Sie die Minimal- und maximaler Seitenverhältniswerte auf 0,4 bzw. 1 fest. Klicken Sie auf OK. Ändern Sie im Feld Name den Text, um BNC zu lesen, und klicken Sie dann auf OK. Erstellen Sie die Features und Diagramme, um die endgültige BNC-Population zu erhalten Spot Count BNC-Funktion: Klicken Sie auf die Registerkarte Analyse, dann Features, dann Neu. Wählen Sie für den Feature-Typ Spot Countaus. Wählen Sie unter Maskedie letzte BNC-Maske aus, die in 9.3.5 erstellt wurde. Legen Sie die Verbindung auf Vier fest, und ändern Sie den Namen in Spot Count BNC. Klicken Sie auf OK und dann auf Schließen, um die Feature-Werte zu berechnen. Spot Count BNC Histogramm. Klicken Sie auf das Histogramm-Symbol. Wählen Sie Nicht-apoptotisch als übergeordnete Grundgesamtheit aus. Wählen Sie für das X-Achsen-Feature die Spot Count BNC-Funktion aus. Klicken Sie auf OK. Klicken Sie auf das Symbol Linearregion. Zeichnen Sie eine Region über bin 2. Rufen Sie diese Region 2Nan.HINWEIS: Siehe Abschnitt 9 in Supplement 1 – Full Protocol, um die verbleibenden Masken, Features und Plots zu erstellen, um die endgültige BNC-Population zu identifizieren 10. Erstellen von Masken und Features zur Identifizierung von MN innerhalb der BNC-Population Erstellen Sie die MN-Maske. Suchen Sie nach einem BNC, der einen MN in der Bildergalerie enthält, und klicken Sie darauf. Damit soll die Erstellung der MN-Maske im Hoechst-Kanal visualisiert werden. Klicken Sie auf die Registerkarte Analyse und dann auf Masken. Spot-Identifikationsmaske erstellen 1: Klicken Sie auf Neu und dann auf Funktion. Wählen Sie unter Funktion Spot aus und stellen Sie sicher, dass das Helle Optionsfeld ausgewählt ist. Wählen Sie unter Maske M07, stellen Sie das Spot-auf-Zell-Hintergrundverhältnis auf 2,00ein. Legen Sie den Mindestradius auf 2 und den maximalen Radius auf 6fest. Klicken Sie auf OK und dann wieder auf OK. Klicken Sie auf Neu und dann auf Funktion. Wählen Sie unter Funktion Bereichaus, und wählen Sie unter Maske LevelSet(M07,Ch07,Middle,3)aus. Legen Sie das Bild auf Ch07fest. Legen Sie die Minimale und maximale Fläche auf 80 bzw. 5000 fest. Legen Sie das Minimale und das maximale Seitenverhältnis auf 0 bzw. 1 fest. Klicken Sie auf OK und dann wieder auf OK. Klicken Sie auf Neu und dann auf Funktion. Wählen Sie unter Funktion Dilate, wählen Sie unter Maske Bereich(LevelSet(M07,Ch07,Mitte,3),80-5000,0-1). Legen Sie das Bild auf Ch07fest. Legen Sie die Anzahl der Pixel auf 2fest. Klicken Sie auf OK und dann wieder auf OK. Klicken Sie auf Neu. Doppelklicken Sie auf die Spot(M07, Ch07, Bright, 2, 6, 2) Maske, um sie der Maskendefinition hinzuzufügen. Klicken Sie auf den Operator Und und dann auf den Not-Operator. Doppelklicken Sie auf die Maske Dilate(Range(LevelSet(M07, Ch07, Middle, 3), 80-5000, 0-1), 2), um sie der Maskendefinition hinzuzufügen. Klicken Sie auf OK. Klicken Sie auf Neu, dann Funktion. Wählen Sie unter Funktion Bereich und unter Maske wählen Sie die Maske in 10.1.1.4 erstellt: Wählen Sie Spot(M07, Ch07, Bright, 2, 6, 2) Und Not Dilate(Range(Levelset(M07, Ch07, Middle, 3), 80-5000, 0-1), 2). Legen Sie das Bild auf “Anzeige” auf Ch07fest. Legen Sie die Minimale und maximale Fläche auf 10 bzw. 80 fest. Legen Sie das Minimale und das maximale Seitenverhältnis auf 0,4 bzw. 1 fest. Klicken Sie auf OK und dann wieder auf OK. Die Spot-Identifikationsmaske 1 ist vollständig.HINWEIS: Siehe Abschnitt 10 in Supplement 1 – Vollständiges Protokoll, um die Masken, Features und Plots zu erstellen, um die endgültige MN-Population zu identifizieren 11. Erstellen Sie Masken, Merkmale und Parzellen, um die mononukleierten und polynukleierten Populationen zu identifizieren Erstellen Sie die POLY-Maske. Klicken Sie auf Analyse, dann Masken, dann Neu und dann Funktion. Wählen Sie unter Funktion Bereich, unter Maske wählen Sie Watershed(Dilate(LevelSet(M07, Ch07, Middle, 3), 2)). Legen Sie das anzuzeigende Bild auf Ch07fest. Legen Sie die Werte “Minimum” und “Maximum Area” auf 135 bzw. 5000 fest. Legen Sie die Werte Minimum und Maximum Aspect Ratio auf 0,4 bzw. 1 fest. Klicken Sie auf OK. Ändern Sie im Feld Name den Text so, dass POLY gelesen wird, und klicken Sie dann auf OK und dann auf Schließen. Die Polynukleated-Zellmaske ist vollständig. Erstellen Sie die POLY-Komponentenmasken. POLY-Komponentenmaske 1: Klicken Sie auf die Registerkarte Analyse, dann Masken, dann Neu, dann Funktion. Wählen Sie unter Funktion Komponenteaus, und wählen Sie unter Maske die POLY-Maske aus. Wählen Sie für Ranking Feature Bereichaus, und für Sortierreihenfolge klicken Sie auf das Optionsfeld Absteigend. Setzen Sie den Rang auf 1. Klicken Sie auf OK und dann wieder auf OK. POLY-Komponentenmasken 2, 3 und 4: Wiederholen Sie alle Schritte in 11.2.1 mit Ausnahme von Rang auf2, 3 und 4, um die einzelnen Komponentenmasken zu erstellen. Spot-Anzahl mit POLY-Maske. Klicken Sie auf die Registerkarte Analyse, dann auf Features, dann neu. Wählen Sie für Feature Typedie Option Spot Countaus. Wählen Sie für Maske die POLY-Maske aus und stellen Sie die Verbundenheit auf 4ein. Klicken Sie auf Standardname festlegen und klicken Sie auf OK, und schließen Sie dann, um die Feature-Werte zu berechnen. Klicken Sie auf das Histogramm-Symbol. Wählen Sie die nicht-apoptotische Population aus. Wählen Sie für das X-Achsen-Feature das Feature Spot Count_POLY_4 aus. MONO Spot-Zählregion. Klicken Sie auf das Symbol Linearregion. Zeichnen Sie einen Bereich über Bin 1 auf dem in 11.3.2 erstellten Histogramm. Rufen Sie diese Region 1Nan. TRI-Spot-Zählregion. Klicken Sie auf das Symbol Linearregion. Zeichnen Sie einen Bereich über Bin 3 auf dem in 11.3.2 erstellten Histogramm. Rufen Sie diese Region 3Nan. QUAD MONO Spot-Zählbereich. Klicken Sie auf das Symbol Linearregion. Zeichnen Sie einen Bereich über bin 4 auf dem in 11.3.2 erstellten Histogramm. Rufen Sie diese Region 4Nan. Identifizieren Sie die MONO-Population. Erstellen Sie das MONO-Seitenverhältnis-Feature. Klicken Sie auf die Registerkarte Analyse, dann auf Features, dann neu. Wählen Sie unter Feature-Typdas Feature Seitenverhältnis aus, und wählen Sie unter Maske Komponente(1, Fläche, POLY, Absteigend)aus. Klicken Sie auf Standardname festlegen, und klicken Sie dann auf OK. Erstellen Sie das MONO-Rundschreiben-Feature. Wenn das Feature-Manager-Fenster noch geöffnet ist, klicken Sie auf Neu. Wählen Sie unter Feature-Typdas Rundungs-Feature aus, und wählen Sie unter Maske Komponente(1, Fläche, POLY, Absteigend)aus. Klicken Sie auf Standardname festlegen, dann auf OK und dann auf Schließen, um die Feature-Werte zu berechnen. Klicken Sie für das kreisförmige MONO-Zellenpunktdiagramm auf das Punktdiagramm. Wählen Sie 1N als übergeordnete Grundgesamtheit aus. Wählen Sie für das X-Achsen-Feature Circularity_Component(1, Area, POLY, Descending) und für das Y-Achsen-Feature Aspect Ratio_Component(1, Area, POLY, Descending)aus. Klicken Sie auf OK. Klicken Sie auf die Schaltfläche Quadratregion, und zeichnen Sie einen Bereich um die Zellenpopulation in Richtung des oberen rechten Teils des Diagramms. Benennen Sie diesen Bereich Circular_1N. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das Diagramm und klicken Sie auf Regionen. Markieren Sie den Circular_1N-Bereich. Ändern Sie die X-Koordinaten in 20 und 55, und ändern Sie die Y-Koordinaten in 0,85 und 1,0. Klicken Sie auf Schließen. Erstellen Sie das Feature Area POLY/Area_M07. Klicken Sie auf die Registerkarte Analyse, dann auf Features, dann neu. Wählen Sie unter Feature-Typdas Area-Feature aus, und wählen Sie unter Maske Komponente(1, Fläche, POLY, Absteigend)aus. Klicken Sie auf Standardname festlegen, und klicken Sie dann auf OK. Wenn das Feature-Manager-Fenster noch geöffnet ist, klicken Sie auf Neu und dann unter Feature-Typ auf das Optionsfeld “Kombiniertes Radio”. Markieren Sie in der Liste der Features die Datei Area_Component(1, Area, POLY, Descending), und klicken Sie auf den Pfeil nach unten, um ihn der Feature-Definition hinzuzufügen. Klicken Sie auf das Divisionssymbol (/). Wählen Sie das Feature Area_M07 aus, und klicken Sie auf den Pfeil nach unten, um es der Feature-Definition hinzuzufügen. Klicken Sie auf Standardname festlegen, und klicken Sie auf OK. Klicken Sie auf Schließen, um mit der Berechnung der Feature-Werte zu beginnen. Klicken Sie für das endgültige MONO-Grunddiagramm auf das Punktdiagrammsymbol. Wählen Sie Circular_1N als übergeordnete Grundgesamtheit aus. Wählen Sie für das X-Achsen-Feature Aspect Ratio_M07 und für das Y-Achsen-Feature Area_Component(1, Area, POLY, Descending) / Area_M07aus. Klicken Sie auf OK. Klicken Sie auf die Schaltfläche Quadratregion, und zeichnen Sie einen Bereich um die meisten Zellen. Nennen Sie diese Region Mononucleated. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das Diagramm und klicken Sie auf Regionen. Markieren Sie die Mononukleated Region. Ändern Sie die X-Koordinaten auf 0,85 und 1,0, und ändern Sie die Y-Koordinaten in 0,55 und 1,0. Klicken Sie auf Schließen.HINWEIS: Siehe Abschnitt 11 in Supplement 1 – Vollständiges Protokoll, um die Masken, Features und Plots zu erstellen, um die endgültigen trinukleierten und polynukleierten Populationen zu identifizieren. 12. Erstellen einer benutzerdefinierten Ansicht zum Untersuchen der BNC- und MN-Masken Klicken Sie auf die Schaltfläche Bildergalerie-Eigenschaften und dann auf die Registerkarte Ansicht. Klicken Sie auf die Registerkarte Composites und dann auf Neu. Unter Name Typ Ch01/Ch07. Klicken Sie auf Bild hinzufügen. Wählen Sie unter Bild Ch01 aus und legen Sie den Prozentsatz auf 100 fest. Klicken Sie erneut auf Bild hinzufügen, wählen Sie unter Bild Ch07 aus und legen Sie den Prozentsatz auf 100 fest. Klicken Sie auf Neu und unter Namenstyp BNC- und MN-Masken Klicken Sie auf Spalte hinzufügen. Wählen Sie unter Bildtyp Ch01 und unter Maske Keine Klicken Sie auf Spalte hinzufügen. Wählen Sie unter Bildtyp Ch07 und unter Maske Keine Klicken Sie auf Spalte hinzufügen. Wählen Sie unter Bildtyp Ch07 und unter Maske BNC Klicken Sie auf Spalte hinzufügen. Wählen Sie unter Bildtyp Ch07 und unter Maske MN-Maske Klicken Sie auf Spalte hinzufügen. Klicken Sie unter Bildtyp auf das Composite-Optionsfeld. Das Ch01/Ch07-Verbundbild sollte der Ansicht automatisch hinzugefügt werden. Klicken Sie auf OK, um das Fenster “Eigenschaften der Bildergalerie” zu schließen. 13. Erstellen einer benutzerdefinierten Ansicht zum Untersuchen der POLY-Maske Siehe Abschnitt 13 in Supplement 1 – Vollständiges Protokoll, um eine benutzerdefinierte Ansicht zum Untersuchen der POLY-Maske zu erstellen 14. Erstellen einer Statistiktabelle zum Aufzählen wichtiger Ereignisse Klicken Sie auf die Registerkarte Berichte und klicken Sie auf Statistikbericht definieren. Klicken Sie im neuen Fenster auf Spalten hinzufügen. Fügen Sie die BNC-Zählstatistik hinzu. Wählen Sie unter Statistik Anzahl und unter Ausgewählte Bevölkerung die BNCs-Population aus. Klicken Sie auf Statistiken hinzufügen, um die Statistik zur Liste hinzuzufügen. Wiederholen Sie Schritt 14.2, um separate Spalten für die MN-BNCs-,MONO-, TRI- und POLY-Populationen zu erstellen. Klicken Sie auf Schließen, dann auf OK. Die Datenanalysevorlage ist vollständig (Abbildung 2). Speichern Sie die Vorlage (Datei, Speichern als Vorlage). Die vollständige Maskenliste finden Sie in Supplement 2 – Maskenliste. 15. Batch-Prozess-Experimentdateien mit der Datenanalysevorlage Klicken Sie im Menü Extras auf Batch-Datendateien und dann im neuen Fenster auf Batch hinzufügen. Klicken Sie im neuen Fenster auf Dateien hinzufügen, um die Experimentdateien (.rif) auszuwählen, die dem Stapel hinzugefügt werden sollen. Klicken Sie unter der Option Vorlage oder Datenanalysedatei auswählen (.ast, .daf) auf das Symbol Ordner öffnen, um die in Schritt 14.4 gespeicherte Datenanalysevorlage (.ast-Datei) zu durchsuchen und zu öffnen. Klicken Sie auf die Schaltfläche Statistikbericht in der Vorschau, um eine Vorschau der Statistiktabelle anzuzeigen. Hier werden keine Werte angezeigt, da sie noch nicht berechnet wurden. Dieser Schritt dient jedoch als Überprüfung, um sicherzustellen, dass die richtige Analysevorlage vor dem Ausführen des Stapels ausgewählt wurde. Klicken Sie auf OK, um das aktuelle Fenster zu schließen. Klicken Sie dann auf Batches senden, um die Stapelverarbeitung aller Dateien zu starten. Wenn die Stapelverarbeitung abgeschlossen ist, ist eine .txt-Datei in dem Ordner verfügbar, der alle .rif-Dateien enthält. Verwenden Sie diese Statistiken, um Genotoxizität und Zytotoxizität zu berechnen. 16. Berechnung der Genotoxizitäts- und Zytotoxizitätsparameter Berechnung der Genotoxizität: Um die Genotoxizität zu berechnen, verwenden Sie die Statistiktabelle, die in 15.5 erstellt wurde. Teilen Sie die Anzahl der Zellen in der MN-BNCs-Population durch die Anzahl der Zellen in der BNCs-Population und multiplizieren Sie sie dann mit 100: Berechnen der Zytotoxizität: Bestimmen Sie die Gesamtzahl der POLY-Zellen, indem Sie die Anzahl der TRI- und QUAD-Zellen summieren. Berechnen Sie den Cytokinesis-Block Proliferation Index (CBPI) mit der Anzahl der Zellen in den MONO, BNCs und POLY wie folgt: Schließlich berechnen Sie die Zytotoxizität jeder Kultur, indem Sie die CBPI-Werte aus den Kontrollkulturen (C) und der chemisch exponierten Kultur (T) wie folgt verwenden:

Representative Results

Die in diesem Dokument beschriebene Analysemethode ermöglicht die automatische Identifizierung und Bewertung von BNCs mit und ohne MN zur Berechnung der Genotoxizität. Darüber hinaus werden MONO- und POLY-Zellen automatisch identifiziert und bewertet, um die Zytotoxizität zu berechnen. Veröffentlichte Bewertungskriterien6,34, die eingehalten werden müssen, wenn diese Ereignisse bewertet werden, werden in der MIFC-Datenanalysesoftware implementiert. Die hier vorgestellten Ergebnisse deuten darauf hin, dass statistisch signifikante Erhöhungen der MN-Frequenz mit zunehmender Zytotoxizität nach Derexposition menschlicher Lymphoblastoid-TK6-Zellen bei bekannten MN-induzierenden Chemikalien (Mitomycin C und Colchicin) nachgewiesen werden können. Ähnliche Ergebnisse für weitere getestete Chemikalien wurden in einer separaten Publikation nachgewiesen32. Darüber hinaus zeigen die Ergebnisse der Verwendung von Mannitol, dass nicht-MN-induzierende Chemikalien auch mit der hier beschriebenen MIFC-Methode korrekt identifiziert werden können. Die im Protokoll beschriebenen Parameter zum Erstellen aller Masken, Features und Regionsgrenzen müssen wahrscheinlich angepasst werden, wenn verschiedene Zelltypen (z. B. chinesische Hamsterzellen) für den Test verwendet werden. Abbildung 3 zeigt vier ausgewählte Panels zur Identifizierung von BNCs (Abbildung 3A-3D). Hier ist ein Histogramm zu sehen, das die Auswahl von Zellen mit zwei Kernen (Abbildung 3A) und bivariaten Diagrammen ermöglicht, die die Auswahl von BNCs mit ähnlicher Zirkularität ermöglichen (Abbildung 3B), ähnliche Bereiche und Intensitäten (Abbildung 3C ) und BNCs, die gut getrennte, nicht überlappende Kerne haben (Abbildung 3D) gemäß der Scoring Critieria6,34. Abbildung 3 E zeigt die BF- und Hoechst-Bilder sowie die BNC- und MN-Masken, die darauf hinweisen, dass BNCs mit einzel- oder mehrfachem MN identifiziert und aufgezählt werden können. Auf diese Weise kann die Genotoxizität berechnet werden, indem die Rate der mikronukleierten BNCs in der endgültigen BNC-Population bestimmt wird. Abbildung 4 zeigt die Anwendung des Spot Count-Features mithilfe der POLY-Maske, um MONO-, TRI- und QUAD-Zellen zu identifizieren. Die Anzahl der TRI- und QUAD-Zellen kann dann summiert werden, um die endgültige Anzahl von POLY-Zellen zu erhalten (Tabelle 1). Auf diese Weise kann die Zytotoxizität unter Verwendung der im Protokoll gezeigten Formel berechnet werden. Daher kann jeder Dosispunkt im Experiment sowohl anhand von Genotoxizitäts- als auch mit Zytotoxizitätsparametern bewertet werden. Abbildung 5 zeigt Genotoxizitäts- und Zytotoxizitätswerte für den Aneugen Colchicin, das Clastogen Mitomycin C und für eine negative Kontrolle, Mannitol. Bei Colchicin (Abbildung 5A) ergaben sich die 0,02 bis 0,05 g/ml-Dosen, die statistisch signifikant zunahmen, von 1,28 % bis 2,44 % gegenüber der Lösungsmittelkontrolle (Tabelle 1). Im Fall von Mitomycin C (Abbildung 5B) ergaben die beiden Top-Dosen von 0,4 und 0,5 g/ml im Vergleich zu Lösungsmittelkontrollen statistisch signifikante MN-Frequenzen. Diese MN-Frequenzen betrugen 0,93 % bei 0,4 g/ml und 1,02 % bei 0,5 g/ml (Tabelle 2). Schließlich haben bei Mannitol (Abbildung 5C) keine getesteten Dosen eine Zytotoxizität von über 30 % induziert, und sie haben auch nicht zu einem signifikanten Anstieg der MN-Frequenz im Vergleich zu Lösungsmittelkontrollen, wie erwartet (Tabelle 3). Abbildung 1 : MIFC-Instrumenteneinstellungen. Ein Screenshot der MIFC-Einstellungen, wie in Abschnitt 7 des Protokolls beschrieben. (A) Einstellung der 405 nm Laserleistung auf 10 mW. (B) Einstellen der BF-Kanäle 1 und 9. (C) Auswahl der 60-fachen Vergrößerungsobjektivlinse. (D) Wählen Sie die langsamste Durchflussgeschwindigkeit, die Bilder mit der höchsten Auflösung erzeugt. (E) Geben Sie die Anzahl der zu sammelnden Ereignisse auf 20.000 an. (F) Klicken Sie auf die Schaltfläche Laden, um den Probenladevorgang zu starten. (G) Klicken Sie auf die Schaltfläche Acquire, um mit dem Erfassen von Bildern zu beginnen. (H) Klicken Sie auf die Schaltfläche Zurück, um ein nicht verwendetes Beispiel zurückzugeben. (I) Streudiagramm von BF-Seitenverhältnis versus BF-Bereich für die Auswahl einzelner Zellen. (J) Streudiagramm von Hoechst Gradient RMS versus BF Gradient RMS für die Auswahl fokussierter Zellen. (K) Histogramm der Hoechst-Intensität zur Auswahl von DNA-positiven Zellen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 2 : Analysesoftware-Gating-Strategie. Ein Screenshot der in Abschnitt 9 des Protokolls beschriebenen Gating-Strategie. Regionen werden in sequenzieller Reihenfolge zur Identifizierung von binukleierten Zellen (roter Kasten), Mikronuklei (gelbe Box) und mono- und polynukleierten Zellen (blaue Box) dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 3 : Identifizierung und Bewertung von BNCs mit und ohne MN. (A) Auswahl von Zellen mit zwei unterschiedlichen Kernen. (B) Identifizierung von binuklierten Zellen (BNCs), die zwei hochkreisförmige Kerne haben, durch die Verwendung der Aspect Ratio Intensity-Funktion. (C) Auswahl von BNCs mit Kernen mit ähnlichen Bereichen und Intensitäten. Dies wird durch die Berechnung des Verhältnisses der Fläche beider Kerne und des Verhältnisses des Seitenverhältnisses beider Kerne erreicht. (D) Verwenden Sie die Shape Ratio- und Aspect Ratio-Features, um BNCs zu identifizieren, die über zwei gut getrennte Kerne verfügen. (E) Die Spot Count-Funktion mit der Micronucleus (MN)-Maske, die zeigt, dass BNCs mit einem oder mehreren MN identifiziert und aufgezählt werden können. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 4 : Identifizierung und Bewertung von MONO- und POLY-Zellen. Verwendung der Spot-Count-Funktion zum Identifizieren und Aufzählen von mono-, tri- und quadranucleated-Zellen. Komponentenmaske 1 ermöglicht die Identifizierung mononukleierter Zellen (oberes Bild). Komponentenmasken 1 bis 3 ermöglichen die Identifizierung trinukleierter Zellen (mittleres Bild). Komponentenmasken 1 bis 4 ermöglichen die Identifizierung von quadranukleierten Zellen (unteres Bild). Diese Zahl wurde von Rodrigues 201832geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 5 : Quantifizierung der Zytotoxizität. Cytotoxizität quantifiziert mit dem Cytokinese-Blockproliferationsindex (schwarze Kreise) und Genotoxizität quantifiziert mit dem Prozentsatz von MN (klare Balken) nach einer 3 h Exposition und 24 h Erholung für (A) Colchicin, (B) Mitomycin C und ( C) Mannitol. Statistisch signifikante Erhöhungen der MN-Frequenz im Vergleich zu Kontrollen werden durch Sterne angezeigt (Chi-Quadrat-Test; *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001). Alle Mengen sind der Durchschnitt von zwei Replikationen an jedem Dosispunkt. Diese Zahl wurde von Rodrigues 201832geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Tabelle 1: Die Parameter, die für die Berechnung der Zytotoxizität (Anzahl der mono-, bi- und polynukleierten Zellen) und der Genotoxizität (Anzahl und Prozentsatz der mikronukleierten Binukleat-Zellen) für Colchicin erforderlich sind. Alle berechneten Mengen sind der Durchschnitt von zwei Replikationen an jedem Dosispunkt. Tabelle 2: D ie Parameter, diezur Berechnung der Zytotoxizität (Anzahl der mono-, bi- und polynukleierten Zellen) und der Genotoxizität (Anzahl und Prozentsatz der mikronukleierten Binukleat-Zellen) für Mitomycin C erforderlich sind. Alle berechneten Mengen sind der Durchschnitt von zwei Replikationen an jedem Dosispunkt. Tabelle 3: Die Parameter, die für die Berechnung der Zytotoxizität (Anzahl der mono-, bi- und polynukleierten Zellen) und der Genotoxizität (Anzahl und Prozentsatz der mikronukleierten Binukleat-Zellen) für Mannitol erforderlich sind. Alle berechneten Mengen sind der Durchschnitt von zwei Replikationen an jedem Dosispunkt. Beilage 1: Vollständiges Protokoll. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen. Beilage 2: Maskenliste. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Discussion

Verma et al. unterstrichen kürzlich die Bedeutung der Entwicklung eines Systems, das den Hohen Durchsatzvorteil der Durchflusszytometrie mit den Daten- und Bildspeichervorteilen der Bildanalyse35kombiniert. Der in vitro MN-Assay MIFC, der in diesem Artikel beschrieben wird, erfüllt dieses Zitat und hat das Potenzial, viele der oben genannten Herausforderungen in der Mikroskopie und Durchflusszytometrie zu meistern. Das hier beschriebene Protokoll zeigt, dass sowohl Zytotoxizität als auch Genotoxizität mit MIFC bewertet werden können. Probenvorbereitung, zelluläre Färbung und Datenerfassung sind einfach, aber es gibt einige wichtige Schritte im Protokoll, die immer implementiert werden sollten. Die Zugabe von Kaliumchlorid (KCl) zu den Zellen ist entscheidend, um die Zellen anzuschwellen, wodurch eine Trennung zwischen den Hauptkernen entsteht. Dadurch wird sichergestellt, dass der Maskierungsalgorithmus alle einzelnen Kerne in BNCs und POLY-Zellen (POLY-Zellen) identifizieren kann, die für ihre Aufzählung erforderlich sind. Darüber hinaus bietet KCL die Trennung zwischen Kernen und MN, was für eine genaue MN-Maskierung und Quantifizierung unerlässlich ist. Darüber hinaus verhindert die Verwendung von Formalin nach Zugabe von KCl, dass Zellen während der Zentrifugation lysieren. Die Zugabe von Cytochalasin B bewirkt, dass TK6-Zellen, die mehr als eine nukleare Teilung durchlaufen haben, ziemlich groß sind. Dadurch wird das Zytoplasma zerbrechlich und kann lyse, wenn die Zentrifugation unmittelbar nach der Zugabe von KCl durchgeführt wird. Darüber hinaus ist es sehr wichtig, Hoechst in die Probe nach der Anzahl der Zellen in der Probe und nicht nach einer endgültigen Konzentration einzuführen. Eine Endkonzentration von 10 g/ml von Hoechst färbt z. B. eine Probe von 1 x 106 Zellen gleichmäßig, kann aber eine Probe mit 5 x 106 Zellen nicht ausreichend färben und kann zu vielen Zellen mit dunkel gefärbten Kernen führen, was die Analyse erschwert. Es ist auch wichtig zu beachten, dass Hoechst durch einen anderen DNA-Farbstoff wie DAPI ersetzt werden kann, wenn der MIFC mit dem 405 nm Anregungslaser oder DRAQ5 ausgestattet ist, wenn der MIFC mit dem Anregungslaser 488 nm und/oder 642nm ausgestattet ist. Bei der Änderung des nuklearen Flecks ist es wichtig, den Fleck zu tittifizieren, um die entsprechende Konzentration für die erforderliche/gewünschte Laserleistung zu finden.

Beim Sammeln von Daten auf der MIFC ist es wichtig, die optimalen Regionsgrenzen für die Gradient RMS-Features zu bestimmen. Die in diesem Protokoll dargelegten Grenzen erfordern möglicherweise aufgrund geringfügiger Abweichungen zwischen MIFC-Instrumenten eine Anpassung. Die Anwendung dieser Funktion während der Datenerfassung ist wichtig, um sicherzustellen, dass hochkonzentrierte Bilder erfasst werden. Wenn Datendateien viele verschwommene oder unfokussierte Bilder enthalten, ist es wahrscheinlich, dass die Maskierungsalgorithmen in der Analysesoftware fälschlicherweise Färbeartefakte in den verschwommenen Bereichen hervorheben, was dazu führt, dass eine hohe Anzahl falsch positiver Artefakte als MN bewertet wird. Obwohl die hier beschriebenen Bildverarbeitungstechniken schwierig sein können, ermöglicht die Batchverarbeitung, sobald eine Analysevorlage in der MIFC-Software entwickelt wurde, die automatische Analyse von Datendateien, wodurch Benutzereingriffe und damit Vorurteil. Wenn für den Test eine andere Zelllinie als TK6-Zellen verwendet wird, müssen die Masken und Regionsgrenzen geändert werden, da sich die morphologischen Eigenschaften (z. B. Größe) von Zellen von denen von TK6-Zellen unterscheiden.

Die hier vorgestellten Ergebnisse (Abbildung 5) zeigen statistisch signifikante Zunahmen der MN-Induktion, wenn TK6-Zellen verschiedenen Dosen von Mitomycin C und Colchicin aussetzen. Statistisch signifikante Erhöhungen der MN-Frequenz im Vergleich zu Lösungsmittelkontrollen wurden bei mehreren Dosen in beiden Chemikalien beobachtet. Darüber hinaus induzierte keine Dosis von Mannitol eine Zytotoxizität von über 30%, noch eine statistisch signifikante Erhöhung der Häufigkeit von MN im Vergleich zu Lösungsmittelkontrollen, wie erwartet. Das in diesem Dokument beschriebene Protokoll, das MIFC zur Durchführung des In-vitro-MN-Assays verwendet, liefert erwartete Ergebnisse sowohl aus positiven als auch aus negativen Kontrollchemikalien. Es ist sehr wichtig, eine Reihe von Experimenten mit Lösungsmittelkontrollen und Negativkontrollchemikalien durchzuführen, um Basiswerte sowohl der MN-Frequenz als auch des Cytokinesis Block Proliferation Index (CBPI) zu entwickeln. Bei der Genotoxizität werden statistisch signifikante Erhöhungen der MN-Frequenz durch Vergleich mit Basis-MN-Frequenzen bestimmt, die für den verwendeten Zelltyp bekannt sein müssen. Darüber hinaus basieren alle Zytotoxizitätsberechnungen auf dem CBPI der Kontrollproben, so dass die Basisraten von MONO-, BNCs- und POLY-Zellen in Kontrollen gut quantifiziert werden müssen.

Die Verwendung von MIFC im Rahmen des MN-Assays wurde in früheren Arbeitenbeschrieben 29,32. Die Haupteinschränkungen betreffen niedrigere MN-Frequenzen im Vergleich zur Mikroskopie, was wahrscheinlich sowohl auf die mangelnde Flexibilität bei der Implementierung der Bewertungskriterien in der Analysesoftware als auch auf die begrenzte Schärfentiefe der MIFC resultiert. Gut konturierte Masken können erstellt werden, um die Hauptkerne genau zu identifizieren, aber MN, die die Hauptkerne berühren (oder sehr nahe) berühren, können innerhalb der BNC-Maske erfasst werden. Darüber hinaus werden sehr kleine MN, die mit Mikroskopie ziemlich leicht bewertet werden können, wahrscheinlich fälschlicherweise übersehen, wenn MIFC verwendet wird, da der Flächenparameter der MN-Maske unter der Grenze liegt, um das Erzielen kleiner Artefakte zu vermeiden. Zusätzlich zu den Schwierigkeiten bei der bildbasierten Datenanalyse erhält MIFC aufgrund seines Designs zweidimensionale Projektionsbilder dreidimensionaler zellulärer Objekte. Dies führt wahrscheinlich dazu, dass einige MN in einer anderen Konzentrationstiefe erfasst werden, die die beiden Haupt-MN, so dass sie sehr dim und un-scorable mit Maskierung erscheinen. Darüber hinaus könnte ein kleiner Bruchteil von MN hinter einem der beiden Hauptkerne liegen, was sie unmöglich macht, zu visualisieren und zu punkten. Daher ist angesichts dieser Schwierigkeiten Vorsicht geboten, wenn man signifikante Erhöhungen der MN-Frequenz bei niedrigen Dosen interpretiert.

Trotz dieser Unzulänglichkeiten bietet die hier beschriebene MIFC-Methode mehrere Vorteile gegenüber anderen Techniken. Fenech et al. schlugen Kriterien und Leitlinien vor, die bei der Entwicklung automatisierter Systeme und Methoden für MN-Assays berücksichtigt werden sollten36. Dazu gehören unter anderem die direkte Visualisierung der Hauptkerne und des Zytoplasmas, die Bestimmung der Häufigkeit von MN aus verschiedenen Dosen der zu prüfenden Chemikalie oder des zu prüfenden Mittels sowie die Fähigkeit, die Morphologie zu quantitieren und die Position aller Kerne und MN, um sicherzustellen, dass sie sich innerhalb des Zytoplasmas befinden. Dieses Papier zeigt, dass die MIFC-Methode, die entwickelt wurde, um den In-vitro-MN-Assay durchzuführen, diese Kriterien erfüllt (oder das Potenzial besitzt, sie zu erfüllen). Insbesondere können Bilder der Kerne und MN von den fluoreszierenden Lasern erfasst werden, während zytoplasmatische Bilder mit der BF-LED erhalten werden können. Bilder von Zellen mit normaler kernatischer Morphologie können automatisch von Zellen mit unregelmäßiger Morphologie mit einer Kombination aus erweiterten Masken und Features unterschieden werden. Die ergebnissegezeigten Ergebnisse für Colchicin und Mitomycin C (Abbildung 5) zeigen, dass sowohl Genotoxizität als auch Zytotoxizität im Vergleich zu Lösungsmittelkontrollen in verschiedenen Dosen bewertet werden können und dass statistisch signifikante MN-Frequenzen beobachtet werden, wenn erwartet. Darüber hinaus empfiehlt die OECD-Testleitlinie 487, 2.000 BNCs pro Testkonzentration zu bewerten, um das Vorhandensein von MN zu bewerten, um die Genotoxizität zusammen mit mindestens 500 Zellen pro Testkonzentration zu bestimmen, um die Zytotoxizität9zu bestimmen; Dies kann über 1 h mit der manuellen Mikroskopie dauern. Das Protokoll und die Ergebnisse dieses Beitrags zeigen, dass durchschnittlich etwa 6.000 BNCs, 16.000 MONO-Zellen und 800 POLY-Zellen erfasst und pro Testkonzentration in etwa 20 min bewertet wurden. Die schnelle Rate der Datenerfassung und die hohe Anzahl von Kandidatenzellen, die in so kurzer Zeit erzielt wurden, verdeutlichen einen weiteren wichtigen Vorteil, indem MIFC für den In-vitro-MN-Test verwendet wird.

Obwohl die in diesem Papier vorgestellten Ergebnisse ermutigend sind, sind sie repräsentativ für eine frühe Proof-of-Concept-Methode. Diese Arbeit sollte durch eine gründlichere Untersuchung eines größeren, vielfältigeren chemischen Satzes, der mehrere Klassen und Mechanismen der Genotoxizität und Zytotoxizität abdeckt, wie sie von Kirkland et al. vorgeschlagen werden, weiterverfolgt werden.37 Die Durchführung solcher Studien ist zeitaufwändig und arbeitsintensiv, und fallen außerhalb des Rahmens dieses Papiers, werden diese größeren Studien jedoch wertvolle Einblicke in die Fähigkeit der Methode, schwach genotoxische Wirkstoffe zuverlässig zu identifizieren. Die hier vorgestellte Methodik wurde noch nicht auf ein Mikrowell-Format miniaturisiert, was ein schnelleres und effizienteres Screening über einen größeren Dosisbereich ermöglichen würde. Daher eignet sich der hier vorgestellte MIFC-basierte In-vitro-MN-Assay in seiner jetzigen Form am besten für arbeitsintensive Nachuntersuchungen oder die Erforschung guter Laborpraktiken. Die Methode wird jedoch weiterhin optimiert und validiert und verfügt über das Potenzial, eine größere Flexibilität beim Nachweis chemischer Ereignisse im Zusammenhang mit der Morphologie zu ermöglichen, wie z. B. eine Aneugen-Exposition, die den Anteil der Zellen mit nicht-kreisförmige Kerne, die noch versenkbar sind38. Schließlich bietet die MIFC-Methode die Möglichkeit, zusätzliche Biomarker in den MN-Assay einzuführen (z. B. Kinetochore-Färbung), um einen umfassenderen Überblick über den Mechanismus der MN-Induktion zu geben.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die Autorin dankt Christine Probst (Luminex Corporation) für ihre Bemühungen, frühere Formen der Datenanalysevorlage zu entwickeln, sowie Dr. Haley Pugsley (Luminex Corporation) und Dr. Phil Morrissey (Luminex Corporation) für die Überprüfung und Bearbeitung der manuskript.

Materials

15 mL centrifuge tube Falcon 352096
Cleanser – Coulter Clenz  Beckman Coulter 8546931 Fill container with 200 mL of Cleanser.  https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/page/itemDetails?itemNumber=8546931#2/10//0/25/1/0/asc/2/8546931///0/1//0/
Colchicine MilliporeSigma 64-86-8
Corning bottle-top vacuum filter  MilliporeSigma CLS430769 0.22 um filter, 500 mL bottle
Cytochalasin B MilliporeSigma 14930-96-2 5 mg bottle
Debubbler – 70% Isopropanol EMD Millipore 1.3704 Fill container with 200 mL of Debubbler.  http://www.emdmillipore.com/US/en/product/2-Propanol-70%25-%28V%2FV%29-0.1-%C2%B5m-filtred,MDA_CHEM-137040?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) MilliporeSigma 67-68-5
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1X EMD Millipore BSS-1006-B PBS Ca++MG++ Free 
Fetal Bovine Serum HyClone SH30071.03
Formaldehyde, 10%, methanol free, Ultra Pure Polysciences, Inc. 04018 This is what is used for the 4% and 1% Formalin. CAUTION: Formalin/Formaldehyde toxic by inhalation and if swallowed.  Irritating to the eyes, respiratory systems and skin.  May cause sensitization by inhalation or skin contact. Risk of serious damage to eyes.  Potential cancer hazard.  http://www.polysciences.com/default/catalog-products/life-sciences/histology-microscopy/fixatives/formaldehydes/formaldehyde-10-methanol-free-pure/
Hoechst 33342 Thermo Fisher H3570 10 mg/mL solution
Mannitol MilliporeSigma 69-65-8
MEM Non-Essential Amino Acids 100X HyClone SH30238.01
MIFC – ImageStreamX Mark II EMD Millipore 100220 A 2 camera ImageStreamX Mark II eqiped with the 405nm, 488nm, and 642nm lasers was used. http://www.emdmillipore.com/US/en/life-science-research/cell-analysis/amnis-imaging-flow-cytometers/imagestreamx-Mark-ii-imaging-flow-cytometer/VaSb.qB.QokAAAFLzRop.zHe,nav?cid=BI-XX-BDS-P-GOOG-FLOW-B325-0006
MIFC analysis software – IDEAS EMD Millipore 100220 The companion software to the MIFC (ImageStreamX MKII)
MIFC software – INSPIRE EMD Millipore 100220 This is the software that runs the MIFC (ImageStreamX MKII)
Mitomycin C MilliporeSigma 50-07-7
NEAA Mixture 100X Lonza BioWhittaker 13-114E
Penicllin/Streptomycin/Glutamine solution 100X Gibco 15070063
Potassium Chloride (KCl) MilliporeSigma P9541
Rinse – Ultrapure water or deionized water NA NA You can use any ultrapure water or deionized water.  Fill container with 900 mL of Rinse.
RNase MilliporeSigma 9001-99-4
RPMI-1640 Medium 1X HyClone SH30027.01
Sheath – PBS EMD Millipore BSS-1006-B This is the same as Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1X  Ca++MG++ free.  Fill container with 900mL of Sheath.
Sterile water HyClone SH30529.01
Sterilizer – 0.4-0.7% Hypochlorite VWR JT9416-1 This is assentually 10% Clorox bleach that can be made by deluting Clorox bleach with water.  Fill container with 200 mL of Sterilzer.
System Calibration Reagent – SpeedBead EMD Millipore 400041 Each tube holds ~10 mL.  https://www.emdmillipore.com/US/en/life-science-research/cell-analysis/amnis-imaging-flow-cytometers/support-training/XDqb.qB.wQMAAAFLBDUp.zHu,nav 
T25 flask Falcon 353109
T75 flask Falcon 353136
TK6 cells MilliporeSigma 95111735
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References

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Rodrigues, M. A. An Automated Method to Perform The In Vitro Micronucleus Assay using Multispectral Imaging Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (147), e59324, doi:10.3791/59324 (2019).
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