JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
生物工程

Een geautomatiseerde methode voor het uitvoeren van de in-vitro micronucleus assay met behulp van multispectrale beeldvormings stroom Cytometrie

Published: May 13, 2019
doi:
10.3791/59324
1Biology Department,Luminex Corporation

Summary

De in-vitro-micronucleustest is een gevestigde methode voor het evalueren van genotoxiciteit en cytotoxiciteit, maar het scoren van de test met behulp van handmatige microscopie is moeizaam en lijdt onder subjectiviteit en variabiliteit tussen de scorer. Dit artikel beschrijft het protocol dat is ontwikkeld om een volledig geautomatiseerde versie van de test uit te voeren met behulp van multispectrale beeldvormings stroom cytometrie.

Abstract

De in-vitro micronucleus (MN) test wordt vaak gebruikt om cytotoxiciteit en genotoxiciteit te evalueren, maar het scoren van de test via handmatige microscopie is moeizaam en introduceert onzekerheid in de resultaten als gevolg van de variabiliteit tussen scorers. Om dit te verhelpen, zijn geautomatiseerde Slide scanning-microscopie en conventionele Flowcytometrie-methoden geïntroduceerd in een poging om scorer bias te verwijderen en de doorvoer te verbeteren. Echter, deze methoden hebben hun eigen inherente beperkingen, zoals onvermogen om te visualiseren van het cytoplasma van de cel en het gebrek aan visuele MN verificatie of beeldgegevens opslag met Flow cytometrie. Multispectrale beeldvormings stroom Cytometrie (MIFC) heeft het potentieel om deze beperkingen te overwinnen. MIFC combineert de hoge resolutie fluorescerende beelden van microscopie met de statistische robuustheid en snelheid van conventionele flow cytometrie. Bovendien kunnen alle verzamelde beelden worden opgeslagen in dosis-specifieke bestanden. Dit artikel beschrijft het protocol dat is ontwikkeld om een volledig geautomatiseerde versie van de MN assay op MIFC uit te voeren. Humane lymfoblastoïde TK6 cellen werden vergroot met een hypotone oplossing (75 mM KCl), vast met 4% formaline en het nucleaire gehalte werd gekleurd met Hoechst 33342. Alle monsters werden uitgevoerd in suspensie op de MIFC, waardoor het verwerven van hoge resolutie beelden van alle belangrijke gebeurtenissen die nodig zijn voor de assay (bv. binucleated cellen met en zonder MN, evenals mononucleated en polynucleated cellen). Beelden werden automatisch geïdentificeerd, gecategoriseerd en geïnventariseerd in de MIFC data analysis software, waardoor geautomatiseerde scoring van zowel cytotoxiciteit en genotoxiciteit. De resultaten tonen aan dat het gebruik van MIFC om de in vitro MN-test uit te voeren, toelaat dat statistisch significante verhogingen in de MN-frequentie worden gedetecteerd op verschillende niveaus van cytotoxiciteit in vergelijking met oplosmiddel controles na blootstelling van TK6 cellen aan En colchicine, en dat er geen significante stijgingen van de MN frequentie worden waargenomen na blootstelling aan mannitol.

Introduction

De in-vitro micronucleus (MN) test is een veelgebruikte proef om cytotoxiciteit en genotoxiciteit te beoordelen als een screening tool in verschillende studiegebieden, zoals chemische en farmaceutische ontwikkeling, evenals menselijke biomonitoring onder personen die zijn blootgesteld aan verschillende milieu-, beroeps-of leefstijlfactoren1,2,3. MN bestaat uit chromosoomfragmenten of hele chromosomen gegenereerd tijdens celdeling die niet zijn opgenomen in een van de twee belangrijkste dochter kernen. Na telophase vormt dit chromosomale materiaal een individueel, afgerond lichaam binnen het cytoplasma dat losstaat van een van de belangrijkste kernen2. Daarom zijn MN representatief voor DNA-beschadiging en zijn ze gedurende vele jaren gebruikt als eindpunt bij genotoxiciteitstests4. De meest geschikte methode om MN te meten is de cytokinesis-block micronucleus (CBMN) test. Met behulp van de CBMN Assay, kan de frequentie van MN in binucleated cellen (Bnc’s) worden gescoord door het opnemen van Cytochalasin B (CYT-B) in het monster. CYT-B staat nucleaire divisie toe, maar voorkomt cellulaire deling en beperkt dus het scoren van MN naar Bnc’s die slechts één keer5hebben gedeeld.

Protocollen die zowel microscopie als flow cytometrie gebruiken zijn ontwikkeld en gevalideerd en worden routinematig gebruikt om de in vitro MN assay6,7,8,9,10, 11,12,13,14. Microscopie voordelen van het kunnen visueel bevestigen dat MN legitiem zijn, maar is tijdrovend en vatbaar voor variabiliteit tussen scorers15. Om dit aan te pakken, zijn geautomatiseerde microscopie methoden ontwikkeld om dia’s te scannen en beelden van kernen en MN16,17,18,19vast te leggen, maar het cytoplasma kan niet worden gevisualiseerd, waardoor het moeilijk om te bepalen of een MN daadwerkelijk is gekoppeld aan een specifieke cel. Bovendien, deze methoden hebben moeilijkheden identificeren van polynucleated (POLY) cellen (met inbegrip van Tri-en quadranucleated cellen) die nodig zijn voor de berekening van de cytotoxiciteit bij het gebruik van CYT-B9. Flowcytometrie methoden die zijn ontwikkeld om de MN-assay uit te voeren, gebruiken fluorescentie en voorwaartse en zijspreidings intensiteiten om populaties van zowel de kernen als de MN te identificeren die uit de cel zijn bevrijd na lysis20,21 ,22. Hierdoor kunnen gegevens van enkele duizenden cellen in enkele minuten worden verkregen en wordt geautomatiseerde analyse23toegestaan; het onvermogen om de cellen te visualiseren maakt het echter onmogelijk om te bevestigen dat gescoord gebeurtenissen echt zijn. Bovendien remt het celmembraan het gebruik van CYT-B, evenals het creëren van een suspensie die ander puin bevat zoals chromosoom aggregaten of apoptotische lichamen en er is geen manier om deze te onderscheiden van MN24.

In het licht van deze beperkingen is multispectrale Imaging flow Cytometry (MIFC) een ideaal systeem om de MN assay uit te voeren, omdat het de hoge resolutie fluorescerende beelden van microscopie combineert met de statistische robuustheid en snelheid van conventionele stromings cytometrie. In MIFC worden alle cellen geïntroduceerd in een fluidics-systeem en worden vervolgens hydrodynamisch geconcentreerd in het midden van een stroomcel Cuvette. Orthogonale verlichting van alle cellen wordt bereikt door het gebruik van een brightfield (BF) lichtuitstralende diode (LED), een side Scatter laser en (tenminste) één fluorescerende laser. Fluorescerende fotonen worden gevangen door een van de drie (20x, 40x of 60x) objectief objectieven met hoge numerieke diafragma en passeren vervolgens een spectrale ontledings element. Fotonen worden vervolgens gericht op een CCD-camera (Charge-gekoppelde apparaat) om afbeeldingen met een hoge resolutie te verkrijgen van alle cellen die door de stroomcel worden doorgegeven. Om te voorkomen dat vervaging of strepen, de CCD werkt in time delay integratie (TDI) modus die objecten traceert door het overbrengen van pixelinhoud van rij naar rij omlaag de CCD in Synchrony met de snelheid van de cel in flow. Pixel informatie wordt vervolgens verzameld uit de laatste rij pixels. Met TDI-beeldvorming in combinatie met spectrale ontleding kunnen maximaal 12 afbeeldingen (2 BF, 10 TL-licht) gelijktijdig worden vastgelegd uit alle cellen die door de stroomcel passeren. Alle vastgelegde beelden worden opgeslagen in voorbeeldspecifieke gegevensbestanden, waardoor analyse op elk moment kan worden uitgevoerd met behulp van de MIFC data analysis software. Ten slotte behouden gegevensbestanden de koppeling tussen cellulaire afbeeldingen en stippen op alle bivariate plots. Dit betekent dat elke stip op een traditioneel bivariate plot kan worden gemarkeerd en dat de bijbehorende BF en fluorescerende beelden25worden weergegeven.

Recentelijk zijn op mifc gebaseerde methoden ontwikkeld om de MN assay te verrichten voor beide triage straling biodosimetrie26,27,28,29,30,31 en genetische Toxicologie32,33 testen. Dit werk heeft aangetoond dat cellulaire beelden van de belangrijkste kernen, MN en het cytoplasma kunnen worden afbeelding gemaakt met hogere doorvoer dan andere methoden26. Alle celtypen die nodig zijn voor analyse, inclusief MONO cellen, Bnc’s (met en zonder MN) en POLY cellen, kunnen automatisch worden geïdentificeerd in de MIFC data analysis software, en de implementatie van de scoring criteria ontwikkeld door Fenech et al. wordt bereikt door het gebruik van verschillende wiskundige algoritmen6,34. De resultaten van biodosimetrie toonden aan dat de kalibratie curves van de dosisrespons vergelijkbaar waren met die van andere geautomatiseerde methoden in de literatuur bij het kwantificeren van de snelheid van MN per BNC29. Bovendien, recent werk in toxicologie toonde aan dat beelden van MONO cellen, Bnc’s (met en zonder MN) en POLY cellen automatisch kunnen worden vastgelegd, geïdentificeerd, geclassificeerd en geïnventariseerd met behulp van MIFC. Het protocol en de gegevensanalyse hebben de berekening van de cytotoxiciteit en genotoxiciteit mogelijk gemaakt na blootstelling van TK6 cellen aan verschillende clastogenen en aneugenen32.

Het in dit artikel gepresenteerde protocol beschrijft een methode om de in vitro MN-assay met MIFC uit te voeren. De in dit werk gebruikte bemonsteringstechniek vereist minder dan 2 uur om een enkel monster te verwerken en is relatief gemakkelijk uit te voeren in vergelijking met andere methoden. De data-analyse in de MIFC-analyse software is ingewikkeld, maar het maken van de analyse sjabloon kan worden bereikt in een paar uur na de stappen die in dit document worden beschreven. Bovendien, zodra het sjabloon is gemaakt, kan het automatisch worden toegepast op alle verzamelde gegevens zonder verdere werkzaamheden. Het protocol schetst alle stappen die nodig zijn om TK6 cellen bloot te stellen aan clastogenen en aneugens, beschrijft hoe cultuur, proces en vlekken van de cellen, en demonstreert het verwerven van hoge resolutie beelden met behulp van MIFC. Bovendien illustreert deze paper de huidige best practices voor het analyseren van gegevens in MIFC-software om automatisch MONO-cellen, Bnc’s en POLY-cellen te identificeren en te scoren met het oog op de berekening van zowel cytotoxiciteit als genotoxiciteit.

Protocol

1. bereiding van de kweekmedium en kweek van TK6 cellen Opmerking: sommige chemicaliën die in dit protocol worden gebruikt, zijn giftig. Het inademen, slikken of contact opnemen met de huid met Cytochalasin B kan fataal zijn. Draag geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen, waaronder een laboratoriumjas en twee paar nitril handschoenen. Was de handen grondig na het hanteren. Formaline/formaldehyde is giftig bij inademing of inslikken; Irriterend voor de ogen, het ademhalingssysteem en de huid; en kan sensibilisatie veroorzaken bij inademing of contact met de huid. Er bestaat een risico op ernstige schade aan de ogen. Het is een potentieel kankerverwekkend. Bereid 565 mL 1x RPMI kweekmedium. Voeg 5 ml niet-essentiële aminozuren (100x), 5 mL natriumpyruvaat (100 mM), 5 mL penicillaire-streptomycine-glutamine (100x) en 50 mL foetaal runderserum (FBS) toe aan een 500 mL fles met 1x RPMI 1640 medium. Bereid het medium in een bioveiligheid Cabinet voor en bewaar het op 2-8 °c. Verwarm het medium tot 37 °C voordat u het toevoegt aan de TK6-cellen (Zie tabel met materialen). Ontdooien 1 mL TK6 cellen (opgeslagen bij-80 °C in DMSO) in 10 mL medium. Centrifugeer de cellen bij 200 x g gedurende 8 minuten en zuig het supernatant op. Breng de cellen over naar 50 ml media en Incubeer bij 37 °c, 5% Co2. De verdubbelingstijd van TK6 cellen varieert van ~ 12-18 h en een paar (3 of 4) passages zullen nodig zijn voor de cellen om hun maximale proliferatie tarief te bereiken (Zie tabel van de materialen). Cultuur 100 mL cellen tot een concentratie van ~ 7-8 x 105 cellen/ml. 2. bereiding van clastogenen en/of aneugenen en Cytochalasin B Bereid de juiste voorraad concentraties van de gewenste clastogenen en aneugenen. Voor mitomycine C moet u bijvoorbeeld een volledige 2 mg fles in 10 mL steriel water oplossen om een uiteindelijke voorraad concentratie van 200 μg/mL te bereiken. Mitomycine C kan gedurende drie maanden bij 4 °C worden bewaard (Zie tabel met materialen). Bereid op de experimentdag verdunningen van de gewenste chemicaliën die ofwel 10-voudige of 100-voudig hoger zijn dan de gewenste blootstellingsconcentraties als ze in steriel water of DMSO verdunden. Voor mitomycine C bereidt u 3 mL verdunningen in steriel water van 0,5, 1,0, 2,0, 3,0, 4,0 en 5,0 μg/mL. Voor colchicine, bereid 3 mL verdunningen in steriel water van 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4 en 0,5 μg/mL. Ten slotte, voor mannitol, bereid 3 mL verdunningen in steriel water van 5, 10, 20, 30, 40 en 50 mg/mL. Bereid een 200 μg/mL stam concentratie van Cytochalasin B door het oplossen van een 5 mg fles in 25 mL DMSO. Cytochalasin B kan gedurende enkele maanden bij-20 °C worden bewaard. 3. blootstelling van cellen aan clastogenen en/of aneugenen Voeg 1 mL gewenste chemische stof (bijv. mitomycine C) toe aan 9 mL cellen bij ~ 7-8 x 105 cellen/ml in een T25 kolf. Voeg voor de controlemonsters 1 mL steriel water toe. Plaats de kolven in een incubator van 37 °C, 5% CO2 voor 3 uur.Opmerking: als chemicaliën in DMSO worden verdund, voeg dan slechts 100 μL van de chemische stof toe aan elke kolf en voeg 100 μL DMSO toe aan controles. Elke kolf moet 9,900 mL cellen bevatten. Verwijder na 3 uur de kolven uit de incubator en breng de cellen over naar 15 mL polypropyleen buizen. Centrifugeer bij 200 x g gedurende 8 minuten, zuig de supernatant op en breng cellen over naar nieuwe maatkolven van T25 die in totaal 10 ml vers kweekmedium bevatten. Voeg aan elke kolf 150 μL van de stam concentratie (200 μg/mL) Cytochalasin B toe om een eindconcentratie van 3 μg/mL te bereiken. Keer de kolven terug naar de 37 °C, 5% CO2 -incubator voor een hersteltijd die gelijk is aan 1,5-2,0 Verdubbelings tijden, zoals aanbevolen in de OESO-richtlijnen9. Voor de TK6 cellen gebruikt in dit werk, de hersteltijd was 24 h.Opmerking: de verdubbelingstijd van de TK6 cellen die hier gebruikt werd was 15 uur en een hersteltijd van 24 uur (1,6 Verdubbelings tijden) werd gebruikt. Hersteltijden minder dan 1,5 Verdubbelings tijden zullen de proliferatie verminderen in monsters die worden blootgesteld aan hogere doseringen die het aantal Bnc’s beïnvloeden. Omgekeerd zal de hersteltijd van meer dan 2,0 een onevenredig aantal polynucleated cellen in de controlemonsters opleveren; scheeftrekking cytotoxiciteit berekeningen. 4. voorbereiding van buffers voor fixatie en etikettering van DNA-inhoud (zie tabel met materialen) Bereid 75 mM kaliumchloride (KCl) voor door 2,79 g toe te voegen aan 500 mL ultrazuiver water. Roer de oplossing 5 minuten door een magneetroerder en steriel filter door een 200 μm filter. De 75 mM KCl-oplossing kan gedurende enkele maanden bij 4 °C worden bewaard. Bereid een voldoende hoeveelheid van 4% formaline voor het experiment, anticiperen op dat een totaal van 2,1 mL moet worden toegevoegd aan elk monster. Als u bijvoorbeeld 10 mL van 4% formaline wilt bereiden, voeg dan 4 mL 10% formaline kolf toe aan 6 mL 1x Dulbecco’s fosfaat-gebufferde zoutoplossing zonder CA2 + of mg2 + (PBS). Deze 4% formaline kan enkele weken bij kamertemperatuur worden bewaard. Bereid 510 mL wasbuffer (2% FBS in 1X PBS) door 10 mL FBS toe te voegen aan een flesje van 500 mL 1x PBS. Bereid 10 mL van een 100 μg/mL-concentratie van Hoechst 33342 door toevoeging van 100 μL van de voorraad concentratie (1 mg/mL) tot 9.900 μL 1X PBS. De Hoechst 33342 oplossing kan gedurende enkele maanden bij 4 °C worden bewaard. 5. monsterverwerking: hypotone zwelling, fixatie, het tellen van cellen en het labelen van DNA-inhoud Verwijder aan het einde van de herstelperiode alle kolven uit de incubator en breng alle monsters over naar 15 mL polypropyleen buizen. Centrifugeer alle monsters bij 200 x g gedurende 8 minuten. Zuig het supernatant op, hervat de cellen en voeg 5 mL 75 mM KCl. meng zachtjes door inversie driemaal en incuberen bij 4 °C gedurende 7 minuten. Voeg 2 mL 4% formaline toe aan elk monster, meng zachtjes door inversie driemaal en incuberen bij 4 °C gedurende 10 minuten. Deze stap fungeert als een “zachte fixatie”. Centrifugeer alle monsters bij 200 x g gedurende 8 min. aspireren de supernatant en respenderen in 100 μL van 4% formaline gedurende 20 minuten. Deze stap fungeert als een “harde fixatie”. Voeg 5 mL wasbuffer toe en centrifugeer bij 200 x g gedurende 8 min. aspireren de supernatant en respenderen in 100 μL wasbuffer. Breng alle monsters over naar 1,5 mL micro centrifugebuizen. Voer op elk voorbeeld een aantal cellen uit om het celbereik per sample te bepalen. De monsters zullen sterk geconcentreerd zijn, dus een 1:100-verdunning in 1x PBS (10 μL monster in 990 μL PBS) zal waarschijnlijk nodig zijn om een nauwkeurig aantal te verkrijgen.Opmerking: op dit punt is het het beste om het aantal cellen met behulp van een hemocytometer uit te voeren. Het toevoegen van KCl geeft het cytoplasma een doorschijnend uiterlijk, waardoor het moeilijk is voor geautomatiseerde celtellers om ze te herkennen. Ook kunnen geautomatiseerde tellers moeite hebben met het scoren van polynucleated cellen vanwege hun grootte. Als de monsters niet onmiddellijk op de MIFC worden uitgevoerd, kunnen ze gedurende meerdere dagen bij 4 °C worden bewaard. Voeg bij het uitvoeren van monsters 5 μL van 100 μg/mL per 1×106 cellen/ml toe aan elk monster. Voeg ook 10 μL van 500 μg/mL RNase per 100 μL monster toe voor een eindconcentratie van 50 μg/mL. Inincuberen de monsters bij 37 °C, 5% CO2 gedurende 30 min. Micro-centrifuge alle monsters bij 200 x g gedurende 8 minuten en gebruik een pipet om de supernatant te verwijderen, waardoor ~ 30 μL. Gebruik een pipet om alle monsters te hervatten voordat u op de MIFC draait, zodat er geen bubbels in de buis zitten. Niet Vortex. 6. starten en kalibreren van de MIFC Zorg ervoor dat de mantel, systeemkalibratie reagens, debubbler, Cleanser en sterilisator containers vol zijn en de afvaltank leeg is. Schakel het systeem in en dubbelklik op het MIFC-softwarepictogram. Klik op de knop opstarten en zorg ervoor dat het selectievakje alle kalibraties en tests starten is aangevinkt. Dit zal het systeem, de load schede en de systeemkalibratie reagentia leegmaken en het systeem kalibreren (Zie tabel met materialen). 7. het uitvoeren van samples op de MIFC Opmerking: deze sectie gaat uit van het gebruik van een 2 camera MIFC. Als u een 1 camera MIFC, zie supplement 1-volledig protocol, sectie 7 voor het maken van percelen tijdens de overname Start de MIFC Data Acquisition software (Zie tabel met materialen). Afbeelding 1 toont de instrumentinstellingen. Schakel de 405 nm laser in en stel de laser stroom in op 10 mW (a). Schakel alle andere lasers (inclusief SSC) uit en stel de BF in op kanalen 1 en 9 (B). Bevestig dat de vergrotings regelaar is ingesteld op 60x (C), de modus voor hoge gevoeligheid is geselecteerd (D) en dat alleen de kanalen 1, 7 en 9 worden weergegeven in de Afbeeldingengalerij. Klik op het pictogram scatterplot . Selecteer de alle populatie en selecteer gebied M01 op de X-as en aspect ratio M01 op de Y-as. Klik op het pictogram vierkante regio en teken een gebied rond de afzonderlijke cellen. Noem deze regio enkele cellen. Klik met de rechtermuisknop op het plot en selecteer regio’s. Markeer het gebied met één cel en verander de x-coördinaten in 100 en 900 en verander de y-coördinaten naar 0,75 en 1 (afbeelding 1I). Klik op het pictogram scatterplot . Selecteer enkelvoudige cellen als bovenliggende populatie, selecteer gradiënt RMS M01 op de X-as en gradiënt RMS M07 op de Y-as. Klik op het pictogram vierkante regio en teken een gebied rond de meerderheid van de cellen. Noem deze regio gerichte cellen. Klik met de rechtermuisknop op het plot en selecteer regio’s. Markeer het gebied met gerichte cellen en verander de x-coördinaten in 55 en 75 en verander de y-coördinaten in 9,5 en 20 (afbeelding 1J). Klik op het histogram pictogram. Selecteer de populatie met gerichte cellen en selecteer intensiteit M07 als de functie. Klik op het pictogram lineaire regio en teken een gebied over de hoofdpiek in het histogram. Noem deze regio DNA-positief. Klik met de rechtermuisknop op het plot en selecteer regio’s. Markeer de DNA-positieve regio en verander de coördinaten naar 2 x 105 en 2 x 106. Het bereik moet mogelijk worden aangepast afhankelijk van de intensiteits piek op het histogram (Figuur 1K). Stel de acquisitie parameters in (Figuur 1E). Geef de bestandsnaam en de doelmap op, wijzig het aantal gebeurtenissen in 20.000 en selecteer de DNA-positieve populatie. Klik op laden (Figuur 1F) en plaats het controlemonster in de mifc. Klik op de knop verwerven om de gegevens te verzamelen (afbeelding 1G). Zodra de acquisitie voltooid is, klikt u op de return -toets om het monster terug te geven (afbeelding 1uur). Verwijder de monsterbuis uit het apparaat. Herhaal dit proces voor alle overgebleven monsters in het experiment. 8. een gegevensbestand openen in ideeën Start het MIFC Analysis softwarepakket (Zie de tabel met materialen). Klik op analyse starten om de wizard bestand openente starten. Selecteer een gegevensbestand door naar het gewenste RAW-afbeeldingsbestand (. rif) te bladeren. Klik op de knop openen en klik op volgende. Aangezien dit een enkele kleur test is, is compensatie niet nodig, dus klik op volgende om de compensatie stap te omzeilen. In dit stadium is er geen analyse sjabloon om toe te passen, dus klik nogmaals op volgende . Als de analyse sjabloon is gedownload van het aanvullende materiaal, selecteert u deze nu. Deze sjablonen werken alleen met een 2 camera MIFC met BF ingesteld op kanalen 1 en 9 en nucleaire beelden in kanaal 7 tijdens de overname. Standaard worden de. cif-en. DAF-bestandsnamen automatisch gegenereerd zodat deze overeenkomen met het. rif. Het is niet aan te raden om de namen van de. cif en. DAF te wijzigen. Klik op volgende. Stel de eigenschappen van de beeldweergave in door de 01 en 07te selecteren. Klik op volgende. Er is geen wizard voor deze toepassing, dus klik op Voltooien. Het is zeer belangrijk om het gegevensanalyse bestand (. DAF) en de analyse sjabloon (. AST) vaak op te slaan tijdens secties 9 – 14 om verlies van vooruitgang te voorkomen. 9. maskers en functies maken om Bnc’s te identificeren Klik op het pictogram Afbeelding galerij eigenschappen (blauw/wit pictogram). Klik op het tabblad weergave-eigenschappen op bereik instellen op pixel gegevens en wijzig vervolgens de kleur in geel. Klik op OK. Hoechst-afbeeldingen zijn nu gemakkelijker te bekijken tegen de zwarte achtergrond. Maak de niet-apoptotic cellen plot. Klik op het tabblad analyse en klik vervolgens op maskers. Klik op Nieuw en klik vervolgens op functie. Onder functie Kies drempel, onder masker Kies M07 en stel het intensiteits percentage in op 50. Klik op OK en nogmaals op OK . Klik op sluiten. Klik op het tabblad analyse , klik op functiesen klik vervolgens op Nieuw. Voor de functie type Selecteer gebied. Selecteer voor masker de drempel (M07, Ch07, 50). Klik op standaardnaam instellen en klik op OK. Klik op sluiten om te beginnen met het berekenen van de functie waarden. Klik op het pictogram stip plot . Selecteer de alle populatie. Voor de functie X-as kiest u de functie Contrast_M01_Ch01 en voor de functie Y-as kiest u Area_Threshold (M07, Ch07, 50). Klik op OK. Klik op de knop vierkante regio en teken een gebied rond de meerderheid van de cellen. Noem deze regio niet-apoptotic. Klik met de rechtermuisknop op het plot en klik op regio’s. Markeer de niet-apoptotic regio. Stel de x-coördinaten in op 0 en 15 en stel de y-coördinaten in op 50 en 300. Klik op sluiten. Maak het BNC-masker (stappen 9.3.1-9.3.5) om cellen te identificeren die slechts twee kernen bevatten. Blader naar een BNC in de Afbeeldingengalerij en klik erop. Dit is om het creëren van het masker in het Hoechst-kanaal te visualiseren. Klik op het tabblad analyse en klik vervolgens op maskers. Klik op Nieuw en klik vervolgens op functie. Onder functie Kies levelset, onder masker Kies M07, selecteer het middelste niveau masker keuzerondje en stel de Contour detail schaal in op 3,00. Klik op OK en nogmaals op OK . Klik op Nieuw en klik vervolgens op functie. Kies onder functiede optie dilateen kies onder masker de optie levelset (M07, Ch07, Middle, 3). Stel de afbeelding in die u wilt weergeven op Ch07en stel het aantal pixels in op 2. Klik op OK en nogmaals op OK . Klik op Nieuw en klik vervolgens op functie. Onder functie Kies waterberging, en onder masker kiezen dilate (levelset (M07, Ch07, Middle, 3) 2). Stel de afbeelding in die u wilt weergeven op Ch07en stel de lijndikte in op 1. Klik op OK en nogmaals op OK . Klik op Nieuw en klik vervolgens op functie. Onder functie Kies bereik, onder masker Kies waterberging (dilate (levelset (M07, Ch07, Middle, 3) 2)). Stel de afbeelding in die u wilt weergeven op Ch07. Stel de minimale en maximale gebieds waarden in op respectievelijk 115 en 5000. Stel de minimum-en maximumwaarden voor de hoogte-breedte verhouding in op respectievelijk 0,4 en 1. Klik op OK. Wijzig in het veld naam de tekst om BNC te lezen en klik vervolgens op OK. Creëer de functies en plots om de uiteindelijke BNC populatie te verkrijgen Spot Count BNC-functie: Klik op het tabblad analyse en vervolgens op functiesen vervolgens op Nieuw. Selecteer voor het functie type Spot Count. Selecteer bij maskerhet uiteindelijke BNC-masker dat is gemaakt in 9.3.5. Stel de verbinding in op vier en verander de naam in Spot Count BNC. Klik op OK en vervolgens op sluiten om de functie waarden te berekenen. Spot Count BNC histogram. Klik op het histogram pictogram. Selecteer niet-apoptotic als de bovenliggende populatie. Kies voor de functie X-as de functie aantal BNC-steun . Klik op OK. Klik op het pictogram lineaire regio. Teken een gebied in opslaglocatie 2. Noem deze regio 2n.Opmerking: Raadpleeg sectie 9 in supplement 1-volledig protocol om de resterende maskers, functies en plots te creëren om de uiteindelijke BNC populatie te identificeren 10. maskers en functies maken om MN binnen de BNC populatie te identificeren Maak het MN-masker. Blader naar een BNC die een MN in de Afbeeldingengalerij bevat en klik erop. Dit is om het creëren van het MN masker in het Hoechst kanaal te visualiseren. Klik op het tabblad analyse en klik vervolgens op maskers. Spot-identificatie masker 1 maken: Klik op Nieuw en klik vervolgens op functie. Kies onder functie Spot en zorg ervoor dat het keuzerondje helder is geselecteerd. Onder masker kiest u M07, stelt u de achtergrond verhouding Spot naar cel in op 2,00. Stel de minimale straal in op 2 en de Maximale straal tot 6. Klik op OK en nogmaals op OK . Klik op Nieuw en klik vervolgens op functie. Onder functie Kies bereik, en onder masker Kies levelset (M07, Ch07, Middle, 3). Stel de afbeelding in die u wilt weergeven op Ch07. Stel het minimum-en maximum gebied in op respectievelijk 80 en 5000. Stel de minimale en maximale beeldverhouding in op respectievelijk 0 en 1. Klik op OK en nogmaals op OK . Klik op Nieuw en klik vervolgens op functie. Onder functie Kies dilate, onder masker Kies bereik (levelset (M07, Ch07, Middle, 3), 80-5000, 0-1). Stel de afbeelding in die u wilt weergeven op Ch07. Stel het aantal pixels in op 2. Klik op OK en nogmaals op OK . Klik op Nieuw. Dubbelklik op de vlek (M07, Ch07, Bright, 2, 6, 2) masker om deze toe te voegen aan de masker definitie. Klik op de operator and en vervolgens op de operator not . Dubbelklik op de dilate (Range (LevelSet (M07, Ch07, midden, 3), 80-5000, 0-1), 2) masker om het toe te voegen aan de masker definitie. Klik op OK. Klik op Nieuwen vervolgens op functie. Onder functie Kies bereik en onder masker Kies het masker gemaakt in 10.1.1.4: Selecteer Spot (M07, Ch07, Bright, 2, 6, 2) en niet dilate (Range (levelset (M07, Ch07, Middle, 3), 80-5000, 0-1), 2). Stel de afbeelding in die u wilt weergeven op Ch07. Stel het minimum-en maximum gebied in op respectievelijk 10 en 80. Stel de minimale en maximale beeldverhouding in op respectievelijk 0,4 en 1. Klik op OK en nogmaals op OK . Vlek identificatie masker 1 is voltooid.Opmerking: Raadpleeg paragraaf 10 in supplement 1-volledig protocol om de maskers, functies en plots te creëren om de uiteindelijke MN populatie te identificeren 11. Creëer maskers, kenmerken en plots om de Mononucleated en Polynucleated populaties te identificeren Maak het POLY masker. Klik op analyse, dan maskers, dan Nieuw dan functie. Onder functie Kies bereik, onder masker Kies waterberging (dilate (levelset (M07, Ch07, Middle, 3), 2)). Stel de afbeelding in die u wilt weergeven op Ch07. Stel de minimale en maximale gebieds waarden in op respectievelijk 135 en 5000. Stel de minimum -en maximum waarden voor de hoogte- breedte verhouding in op respectievelijk 0,4 en 1. Klik op OK. In de naam veld, wijzig de tekst om te lezen poly klik vervolgens op OK dan sluiten. Het Gepolynucleated celmasker is voltooid. Maak de POLY-component maskers. POLY component mask 1: Klik op het tabblad analyse , dan maskers, dan Nieuw, dan functie. Onder functie Selecteer component, en onder masker selecteert u het poly masker. Voor rangschikking functie selecteren gebied, en voor sorteervolgorde Klik op het aflopende keuzerondje. Stel de rang in op 1. Klik op OK en nogmaals op OK . POLY component maskers 2, 3 en 4: Herhaal alle stappen in 11.2.1 behalve Stel rang op 2, 3 en 4 om de afzonderlijke component maskers te maken. Aantal vlekken met behulp van POLY masker. Klik op het tabblad analyse en vervolgens op functiesen vervolgens op Nieuw. Selecteer voor het functie type Spot Count. Voor masker Kies het poly masker en stel de verbondenheid op 4. Klik op standaardnaam instellen en klik op OK en vervolgens op sluiten om de functie waarden te berekenen. Klik op het histogram pictogram. Selecteer de niet-apoptotic populatie. Kies voor de functie X-as de functie Spot Count_POLY_4 . MONO spot Count regio. Klik op het pictogram lineaire regio. Teken een gebied over opslaglocatie 1 op het histogram dat is gemaakt in 11.3.2. Noem deze regio 1N. Regio voor TRI-spot telling. Klik op het pictogram lineaire regio. Teken een gebied over opslaglocatie 3 op het histogram dat is gemaakt in 11.3.2. Noem deze regio 3n. Aantal QUAD MONO spot Count regio. Klik op het pictogram lineaire regio. Teken een gebied over opslaglocatie 4 op het histogram dat is gemaakt in 11.3.2. Noem deze regio 4n. Identificeer de MONO-populatie. Maak de functie MONO-beeldverhouding. Klik op het tabblad analyse en vervolgens op functiesen vervolgens op Nieuw. Selecteer onder functie typede functie voor de hoogte- breedte verhouding en selecteer onderdeel masker selecteren (1, gebied, poly, aflopend). Klik op standaardnaam instellen en vervolgens op OK. Maak de functie MONO Circulariteit. Klik op Nieuwals het venster functie beheer nog steeds is geopend. Selecteer onder onderdeel typede functie Circulariteit en onder masker selecteren (1, gebied, poly, aflopend). Klik op standaardnaam instellen en vervolgens op OK en vervolgens op sluiten om de functie waarden te berekenen. Voor de cirkelvormige MONO cellen stip plot, klikt u op het pictogram stip plot . Selecteer 1N als de bovenliggende populatie. Voor de functie X-as kiest u Circularity_Component (1, gebied, poly, aflopend) en voor de functie Y-as kiest u aspect Ratio_Component (1, gebied, poly, aflopend). Klik op OK. Klik op de knop vierkante regio en teken een gebied rond de celpopulatie naar het rechterbovenhoek gedeelte van het plot. Noem deze regio Circular_1N. Klik met de rechtermuisknop op het plot en klik op regio’s. Markeer de regio Circular_1N . Wijzig de X-coördinaten in 20 en 55 en wijzig de Y-coördinaten in 0,85 en 1,0. Klik op sluiten. Maak het gebied POLY/Area_M07 functie. Klik op het tabblad analyse en vervolgens op functiesen vervolgens op Nieuw. Selecteer onder onderdeel typede functie gebied en onder masker selecteren (1, gebied, poly, aflopend). Klik op standaardnaam instellen en vervolgens op OK. Klik terwijl het venster functie beheer nog steeds is geopend op Nieuw en klik onder functie type op het gecombineerde keuzerondje. Markeer in de lijst met functies de Area_Component (1, Area, poly, aflopend) en klik op de pijl-omlaag om deze toe te voegen aan de functiedefinitie. Klik op het delings symbool (/). Selecteer de functie Area_M07 en klik op de pijl-omlaag om deze toe te voegen aan de functiedefinitie. Klik op standaardnaam instellen en klik op OK. Klik op sluiten om te beginnen met het berekenen van de functie waarden. Voor de uiteindelijke MONO-populatie stip plot, klikt u op het pictogram stip plot . Selecteer Circular_1N als de bovenliggende populatie. Kies voor de functie X-as aspect Ratio_M07 en voor de functie Y-as Kies Area_Component (1, gebied, poly, aflopend)/Area_M07. Klik op OK. Klik op de knop vierkante regio en teken een gebied rond de meerderheid van de cellen. Noem deze regio Mononucleated. Klik met de rechtermuisknop op het plot en klik op regio’s. Markeer het Mononucleated gebied. Verander de X-coördinaten in 0,85 en 1,0 en verander de Y-coördinaten in 0,55 en 1,0. Klik op sluiten.Opmerking: Raadpleeg paragraaf 11 in supplement 1-volledig protocol om de maskers, kenmerken en plots te creëren om de uiteindelijke trinucleated en polynucleated populaties te identificeren. 12. Maak een aangepaste weergave om de BNC-en MN-maskers te bekijken Klik op de Afbeelding galerij eigenschappen knop en klik vervolgens op de View tab. Klik op het tabblad composieten en klik vervolgens op Nieuw. Onder naam type Ch01/Ch07. Klik op afbeelding toevoegen . Kies onder afbeelding Ch01 en stel het percentage in op 100. Klik nogmaals op afbeelding toevoegen , Kies onder afbeelding Ch07 en stel het percentage in op 100. Klik op Nieuw en onder naam type BNC en MN maskers Klik op kolom toevoegen. Kies onder afbeeldings type Ch01 en onder masker Kies geen Klik op kolom toevoegen. Kies onder afbeeldings type Ch07 en onder masker Kies geen Klik op kolom toevoegen. Kies onder afbeeldings type Ch07 en onder masker Kies BNC Klik op kolom toevoegen. Onder afbeeldings type Kies Ch07 en onder masker Kies MN Mask Klik op kolom toevoegen. Klik onder afbeeldings type op het keuzerondje samengesteld . De samengestelde afbeelding Ch01/Ch07 moet automatisch worden toegevoegd aan de weergave. Klik op OK om het venster Eigenschappen van afbeeldingsgalerie te sluiten. 13. Maak een aangepaste weergave om het POLY masker te onderzoeken Raadpleeg paragraaf 13 in supplement 1-volledig protocol om een aangepaste weergave te maken om het POLY masker te onderzoeken 14. een tabel met statistieken maken voor het inventariseren van belangrijke gebeurtenissen Klik op het tabblad rapporten en klik vervolgens op statistiekenrapport definiëren. Klik in het nieuwe venster op kolommentoevoegen. Voeg de statistiek BNC Count toe. Kies onder Statistieken selecteren aantal en onder geselecteerde populatie de bncs -populatie. Klik op Statistieken toevoegen om de statistiek aan de lijst toe te voegen. Herhaal stap 14,2 om afzonderlijke kolommen te maken voor de populaties MN BNCs, mono, Tri en poly . Klik op sluiten en vervolgens op OK. De sjabloon voor gegevensanalyse is voltooid (afbeelding 2). Sla de sjabloon op (bestand, opslaan als sjabloon). De lijst met volledige maskers kan worden gevonden in supplement 2-masker lijst. 15. experiment bestanden batchgewijs verwerken met de sjabloon voor gegevensanalyse Klik in het menu extra op batchgegevens bestanden en klik vervolgens op batch toevoegen in het nieuwe venster. Klik in het nieuwe venster op bestanden toevoegen om de experiment bestanden (. rif) te selecteren die u aan de batch wilt toevoegen. Klik onder de optie Selecteer een sjabloon of gegevensanalyse bestand (. AST,. DAF) op het pictogram map openen om naar de gegevensanalyse sjabloon (. AST-bestand) te bladeren die is opgeslagen in stap 14,4. Klik op de knop rapport statistieken bekijken om een voorvertoning van de tabel met statistieken weer te geven. Hier worden geen waarden weergegeven, omdat ze nog niet zijn berekend. Deze stap dient echter als een controle om ervoor te zorgen dat de juiste analyse sjabloon is geselecteerd voordat de batch wordt uitgevoerd. Klik op OK om het huidige venster te sluiten. Klik vervolgens op batches verzenden om de batchverwerking van alle bestanden te starten. Wanneer de batchverwerking is voltooid, is een. txt-bestand beschikbaar in de map die alle. rif-bestanden bevat. Gebruik deze statistieken om genotoxiciteit en cytotoxiciteit te berekenen. 16. berekening van de genotoxiciteit-en cytotoxiciteits parameters Genotoxiciteit berekenen: gebruik de tabel met statistieken die is gemaakt in 15,5 om genotoxiciteit te berekenen. Verdeel het aantal cellen in de MN BNCs-populatie door het aantal cellen in de BNCs-populatie en vermenigvuldig vervolgens met 100: Berekening van de cytotoxiciteit: Bepaal het totale aantal POLY cellen door het aantal TRI-en QUAD-cellen op te vatten. Bereken de cytokinesis-block proliferatie index (CBPI) door het aantal cellen in de MONO, BNCs en POLY als volgt te gebruiken: Bereken ten slotte de cytotoxiciteit van elke cultuur door de CBPI-waarden van de controleculturen (C) en de chemisch blootgestelde cultuur (T) als volgt te gebruiken:

Representative Results

De analysemethode die in dit document wordt beschreven, maakt de automatische identificatie en scoring van Bnc’s, met en zonder MN, mogelijk om genotoxiciteit te berekenen. Bovendien worden MONO-en POLY-cellen ook automatisch geïdentificeerd en gescoord om cytotoxiciteit te berekenen. Gepubliceerde beoordelingscriteria6,34 die moeten worden nageleefd bij het scoren van deze gebeurtenissen worden geïmplementeerd in de mifc data analysis software. De hier gepresenteerde resultaten geven aan dat statistisch significante stijgingen van de MN-frequentie met toenemende cytotoxiciteit kunnen worden gedetecteerd na blootstelling van menselijke lymfoblastoïde TK6 cellen aan bekende MN-inducerende chemicaliën (mitomycine C en colchicine). Vergelijkbare resultaten voor extra geteste chemicaliën zijn aangetoond in een aparte publicatie32. Bovendien, resultaten van het gebruik van mannitol tonen dat niet-MN inducerende chemicaliën kunnen ook correct worden geïdentificeerd met behulp van de MIFC methode hier geschetst. De parameters die in het protocol worden beschreven om alle maskers, functies en regio grenzen te maken, moeten waarschijnlijk worden aangepast als er verschillende celtypen (bijvoorbeeld Chinese Hamster cellen) worden gebruikt om de test uit te voeren. In Figuur 3 worden vier geselecteerde deelvensters weergegeven om bnc’s te identificeren (Figuur 3A-3D). Hier wordt een histogram weergegeven dat de selectie van cellen mogelijk maakt met twee kernen (Figuur 3a) en bivariate plots die de selectie van bnc’s met vergelijkbare circulariteit mogelijk maken (Figuur 3B), vergelijkbare gebieden en intensiteiten (Figuur 3C ) en Bnc’s met goed gescheiden, niet-overlappende kernen (Figuur 3D) volgens de scoring filtercritieria6,34. Figuur 3 E toont de BF-en Hoechst-beelden, evenals de BNC-en MN-maskers die aangeven dat bnc’s met één of meerdere MN kunnen worden geïdentificeerd en geïnventariseerd. Hierdoor kan genotoxiciteit worden berekend door de snelheid van Bnc’s met micronuclei in de uiteindelijke BNC populatie te bepalen. Figuur 4 toont de toepassing van de functie voor het aantal vlekken met behulp van het poly masker om mono-, Tri-en Quad-cellen te identificeren. Het aantal TRI-en QUAD-cellen kan vervolgens worden samengevat om het uiteindelijke aantal POLY cellen te verkrijgen (tabel 1). Dit maakt het mogelijk cytotoxiciteit te berekenen met behulp van de formule die wordt weergegeven in het protocol. Daarom kan elk doserings punt in het experiment worden geëvalueerd door zowel genotoxiciteit als cytotoxiciteits parameters. Figuur 5 toont genotoxiciteit-en cytotoxiciteits waarden voor de Aneugen colchicine, de clastogeen mitomycin C en voor een negatieve controle, mannitol. Voor colchicine (Figuur 5A) produceerde de 0,02 tot en met 0,05 μg/ml doses statistisch significante stijgingen in de frequentie van MN, variërend van 1,28% tot 2,44% over de oplosmiddel regeling (tabel 1). In het geval van mitomycine C (Figuur 5B) produceerde de twee topdoseringen van 0,4 en 0,5 μg/ml statistisch significante MN-frequenties in vergelijking met oplosmiddel controles. Deze MN frequenties waren 0,93% bij 0,4 μg/mL en 1,02% bij 0,5 μg/mL (tabel 2). Tot slot, voor mannitol (Figuur 5C), geen geteste doses induceren een cytotoxiciteit meer dan 30%, noch produceren ze significante stijgingen in MN frequentie in vergelijking met oplosmiddel controles, zoals verwacht (tabel 3). Figuur 1 : Mifc instrumentinstellingen. Een screenshot van de MIFC-instellingen zoals beschreven in sectie stap 7 van het protocol. A) het Laser vermogen van 405 nm instellen op 10 MW. B) de BF-kanalen 1 en 9 instellen. (C) de objectief lens met een vergroting van 60x selecteren. D) selecteren van de traagste stroomsnelheid die beelden genereert met de hoogste resolutie. E) specificeren van het aantal te verzamelen gebeurtenissen tot en met 20.000. (F) klikken op de knop laden om het laadproces van het monster te starten. (G) klikken op de knop verwerven om te beginnen met het verwerven van afbeeldingen. (H) als u op de return -knop klikt om het ongebruikte monster te retourneren. (I) scatterplot van BF-beeldverhouding versus BF-gebied voor de selectie van afzonderlijke cellen. J) scatterplot van Hoechst gradiënt RMS versus BF gradiënt RMS voor de selectie van gefocuste cellen. K) histogram van Hoechst-intensiteit voor de selectie van DNA-positieve cellen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. Figuur 2 : Analyse software gating strategie. Een screenshot van de gating-strategie die wordt beschreven in paragraaf 9 van het protocol. Regio’s worden in sequentiële volgorde weergegeven voor de identificatie van binucleated cellen (rode doos), micronuclei (gele doos) en mono-en polynucleated cellen (blauwe doos). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. Figuur 3 : Identificatie en scoring van Bnc’s met en zonder MN. A) selectie van cellen met twee verschillende kernen. B) identificatie van binucleated cellen (bnc’s) met twee zeer circulaire kernen door het gebruik van de intensiteit van de aspect ratio. C) selectie van bnc’s met kernen met soortgelijke gebieden en intensiteiten. Dit wordt bereikt door het berekenen van de verhouding van het gebied van beide kernen en de verhouding van de beeldverhouding van beide kernen. D) gebruik van de vorm verhouding en de hoogte-breedte verhouding om bnc’s met twee goed gescheiden kernen te identificeren. E) de functie spot Count met behulp van het micronucleus masker (MN) waaruit blijkt dat bnc’s met enkelvoudige of meervoudige MN kunnen worden geïdentificeerd en geïnventariseerd. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. Figuur 4 : Identificatie en scoring van mono-en Poly-cellen. Gebruik van de functie steek telling om mono-, Tri-en quadranucleated cellen te identificeren en te inventariseren. Component mask 1 maakt de identificatie mogelijk van mononucleated cellen (bovenste afbeelding). Component maskers 1 tot en met 3 kunnen de identificatie van trinucleated cellen (middelste afbeelding). Component maskers 1 tot en met 4 kunnen de identificatie van kwadrranucleated cellen (onderste afbeelding). Dit cijfer is gewijzigd van Rodrigues 201832. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. Figuur 5 : Kwantificering van cytotoxiciteit. Cytotoxiciteit gekwantificeerd met behulp van de cytokinese-blok proliferatie-index (zwarte cirkels) en genotoxiciteit gekwantificeerd met behulp van het percentage mn (heldere staven) na een blootstelling van 3 uur en 24 h herstel voor (a) colchicine, (B) mitomycine C en ( C) mannitol. Statistisch significante stijgingen van de MN-frequentie in vergelijking met besturingselementen worden aangegeven door sterren (Chi-kwadraat test; *p < 0,05, * *p < 0,01, * * *p < 0,001). Alle hoeveelheden zijn het gemiddelde van twee replicaten bij elk dosis punt. Dit cijfer is gewijzigd van Rodrigues 201832. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. Tabel 1: De parameters die nodig zijn voor het berekenen van de cytotoxiciteit (het aantal mono-, bi-en polynucleated cellen) en genotoxiciteit (het aantal en percentage van gemicronucleeerde cellen met een binucleated) voor colchicine. Alle berekende hoeveelheden zijn het gemiddelde van twee replicaten bij elk dosis punt. Tabel 2: Deparameters die nodig zijn voor de berekening van de cytotoxiciteit (het aantal mono-, bi-en polynucleated cellen) en genotoxiciteit (het aantal en percentage van gemicronucleeerde cellen met een binocaal) voor mitomycine C. Alle berekende hoeveelheden zijn het gemiddelde van twee replicaten bij elk dosis punt. Tabel 3: De parameters die nodig zijn voor de berekening van de cytotoxiciteit (het aantal mono-, bi-en polynucleated cellen) en genotoxiciteit (het aantal en percentage van gemicronucleeerde cellen in de groep) voor mannitol. Alle berekende hoeveelheden zijn het gemiddelde van twee replicaten bij elk dosis punt. Supplement 1: volledig protocol. Klik hier om dit bestand te downloaden. Supplement 2: masker lijst. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussion

In een recente publicatie onderstreepte Verma et al. het belang van het ontwikkelen van een systeem dat het hoge doorvoer voordeel van flow cytometrie combineert met de gegevens-en beeldopslag voordelen van beeldanalyse35. De MIFC in vitro MN assay beschreven in dit document voldoet aan deze offerte en heeft het potentieel om veel van de bovengenoemde uitdagingen in microscopie en flow cytometrie methoden te overwinnen. Het hier beschreven protocol toont aan dat zowel cytotoxiciteit als genotoxiciteit kunnen worden geëvalueerd met behulp van MIFC. Monstervoorbereiding, cellulaire kleuring en gegevensverzameling zijn eenvoudig, maar er zijn enkele kritieke stappen in het protocol die altijd moeten worden geïmplementeerd. Toevoeging van kaliumchloride (KCl) aan de cellen is essentieel voor het opzwellen van de cellen, waardoor scheiding tussen de belangrijkste kernen wordt gegenereerd. Dit zorgt ervoor dat de maskerings algoritme kan identificeren alle individuele kernen in BNCs en POLY cellen (POLY cellen) die nodig is voor hun opsomming. Daarnaast biedt KCL scheiding tussen kernen en MN, wat essentieel is voor nauwkeurige MN-masking en kwantatie. Bovendien voorkomt het gebruik van formalin na de toevoeging van KCl dat cellen tijdens het centrifugeren geen lyseren hebben. De toevoeging van Cytochalasin B veroorzaakt TK6 cellen die meer dan één nucleaire divisie hebben ondergaan om vrij groot te zijn. Als gevolg hiervan wordt het cytoplasma fragiel en kan lyse als centrifugeren onmiddellijk na de toevoeging van KCl wordt uitgevoerd. Bovendien is het zeer belangrijk om Hoechst in het monster te introduceren volgens het aantal cellen in het monster en niet volgens een eindconcentratie. Een eindconcentratie van 10 μg/mL Hoechst zal bijvoorbeeld een monster van 1 x 106 cellen gelijkmatig vlekken, maar kan een monster met 5 x 106 cellen niet adequaat vlekken en kan resulteren in veel cellen met slecht Bevlekt kernen, waardoor de analyse moeilijk wordt. Het is ook belangrijk op te merken dat Hoechst kan worden vervangen door een andere DNA-kleurstof zoals DAPI als de MIFC is uitgerust met de 405 nm excitatie laser of DRAQ5 als de MIFC is uitgerust met de 488 nm en/of 642nm excitatie Laser (s). Bij het wijzigen van de nucleaire vlek is het van cruciaal belang om de vlek te titreren om de juiste concentratie te vinden voor het gewenste/gewenst Laser vermogen.

Bij het verzamelen van gegevens over de MIFC is het belangrijk om de optimale regio grenzen te bepalen voor de RMS-functies voor verloop. De grenzen die in dit protocol worden voorgesteld, kunnen worden aangepast als gevolg van enkele kleine variaties tussen MIFC-instrumenten. De toepassing van deze functie tijdens het verzamelen van gegevens is essentieel om ervoor te zorgen dat zeer gerichte beelden worden vastgelegd. Als gegevensbestanden veel vage of ongerichte afbeeldingen bevatten, is het waarschijnlijk dat de maskeer algoritmen in de analyse software ten onrechte kleurings artefacten in de vervaagde gebieden zullen markeren, wat leidt tot een groot aantal valse positieve artefacten die worden gescoord als MN. Hoewel de beeldverwerkingstechnieken die hier worden beschreven moeilijk kunnen zijn, zodra een analyse sjabloon is ontwikkeld in de MIFC-software, maakt batchverwerking het mogelijk om gegevensbestanden automatisch te analyseren, waardoor gebruikersinterventie wordt geëlimineerd en daarom scorer Bias. Ook als een andere cellijn dan TK6 cellen worden gebruikt om de assay uit te voeren, zal het nodig zijn om de maskers en regio grenzen te wijzigen als de morfologische eigenschappen (bijv. grootte) van cellen zullen afwijken van die van TK6 cellen.

De resultaten die hier worden weergegeven (Figuur 5) vertonen een statistisch significante toename van de MN-inductie bij blootstelling aan TK6 cellen aan verschillende doses mitomycine C en colchicine. Statistisch significante verhogingen in de frequentie van MN in vergelijking met oplosmiddel controles werden waargenomen voor verschillende doses in beide chemicaliën. Bovendien veroorzaakte geen enkele dosis mannitol een cytotoxiciteit van meer dan 30%, noch een statistisch significante toename van de frequentie van MN in vergelijking met oplosmiddel controles, zoals verwacht. Het in dit document beschreven protocol dat MIFC gebruikt om de in vitro MN-test uit te voeren, geeft de verwachte resultaten van zowel positieve als negatieve controle chemicaliën. Het is zeer belangrijk om een aantal experimenten uit te voeren met zowel oplosmiddel controles als negatieve controle chemicaliën om baselinewaarden te ontwikkelen van zowel de frequentie van MN als de cytokinesis block proliferatie index (CBPI). Voor genotoxiciteit worden statistisch significante stijgingen van de frequentie van MN bepaald door vergelijking met Baseline MN-frequenties die bekend moeten zijn voor het gebruikte celtype. Daarnaast zijn alle cytotoxiciteits berekeningen gebaseerd op de CBPI van de controlemonsters en daarom moeten Baseline percentages van MONO, BNCs en POLY cellen goed worden gekwantificeerd in controles.

Verschillende beperkingen en voordelen van het gebruik van mifc in het kader van de MN assay zijn beschreven in vorig werk29,32. De belangrijkste beperkingen hebben betrekking op lagere MN-frequenties in vergelijking met microscopie, wat waarschijnlijk het gevolg is van het gebrek aan flexibiliteit bij het implementeren van de scoringscriteria in de analyse software en de beperkte scherptediepte van de MIFC. Goed voorgevormde maskers kunnen worden gemaakt om de belangrijkste kernen nauwkeurig te identificeren, maar MN die raken (of heel dicht bij) de belangrijkste kernen kunnen worden gevangen in het BNC-masker. Bovendien, zeer kleine MN die vrij gemakkelijk kan worden gescoord met behulp van microscopie zijn waarschijnlijk verkeerd gemist bij het gebruik van MIFC vanwege de ondergrens van het gebied parameter van de MN masker om te voorkomen dat kleine artefacten scoren. Naast de moeilijkheden in beeld-gebaseerde data-analyse, als gevolg van het ontwerp, verkrijgt MIFC twee dimensionale projectie beelden van driedimensionale cellulaire objecten. Dit zorgt ervoor dat sommige MN worden gevangen op een andere diepte van focus die de twee belangrijkste MN, waardoor ze lijken zeer Dim en niet-scorable met behulp van maskering. Bovendien, een kleine fractie van MN kon wonen achter een van de twee belangrijkste kernen, waardoor ze onmogelijk te visualiseren en te scoren. Daarom, gezien deze moeilijkheden, voorzichtigheid moet worden gebruikt bij het interpreteren van significante verhogingen in MN frequentie bij lage doses.

Ondanks deze tekortkomingen biedt de hier beschreven MIFC-methode verschillende voordelen ten opzichte van andere technieken. Fenech et al. voorgestelde criteria en richtsnoeren die moeten worden overwogen bij de ontwikkeling van geautomatiseerde systemen en methodologieën voor MN assays36. Deze omvatten, maar zijn niet beperkt tot, directe visualisatie van de belangrijkste kernen en cytoplasma, bepaling van de frequentie van MN van verschillende doses van de chemische stof of de agent die wordt getest en het vermogen om morfologie te kwantificen bepalen de positie van alle kernen en MN om ervoor te zorgen dat ze binnen het cytoplasma. Dit artikel toont aan dat de MIFC-methode die is ontwikkeld om de in vitro MN-test uit te voeren, voldoet aan (of het potentieel heeft om aan deze criteria te voldoen). Specifiek, beelden van de kernen en MN kunnen worden gevangen door de fluorescerende lasers terwijl cytoplasmische beelden kunnen worden verkregen door gebruik te maken van de BF LED. Beelden van cellen met een normale nucleaire morfologie kunnen automatisch worden onderscheiden van die cellen met onregelmatige morfologie met behulp van een combinatie van geavanceerde maskers en functies. De resultaten voor colchicine en mitomycin C (Figuur 5) tonen aan dat zowel genotoxiciteit als cytotoxiciteit bij verschillende doseringen kunnen worden beoordeeld in vergelijking met oplosmiddel controles en dat statistisch significante MN-frequenties worden waargenomen waar Verwacht. Bovendien raadt de OESO-testrichtlijn 487 aan om 2.000 Bnc’s per testconcentratie te scoren om de aanwezigheid van MN te beoordelen, samen met ten minste 500 cellen per testconcentratie om cytotoxiciteit9te bepalen; Dit kan meer dan 1 uur duren met behulp van handmatige microscopie. Het protocol en de resultaten in dit document tonen aan dat een gemiddelde van ongeveer 6.000 Bnc’s, 16.000 MONO cellen, en 800 POLY cellen werden gevangen en scoorde per testconcentratie in ongeveer 20 min. De snelle data-acquisitie en de hoge aantallen kandidaatcellen die in zo’n korte tijd zijn gescoord, benadrukken een ander belangrijk voordeel van het gebruik van MIFC om de in vitro MN-test uit te voeren.

Hoewel de resultaten die in dit document worden gepresenteerd bemoedigend zijn, zijn ze representatief voor een vroege proof-of-concept methode. Dit werk moet worden opgevolgd door een meer grondig onderzoek van een grotere, meer diverse chemische verzameling die betrekking heeft op meerdere klassen en mechanismen van genotoxiciteit en cytotoxiciteit zoals die voorgesteld door Kirkland et al.37 het uitvoeren van dergelijke studies zijn tijdrovend en arbeidsintensief, en vallen buiten het bestek van dit papier echter, deze grootschalige studies zullen waardevol inzicht geven in het vermogen van de methode om zwak genotoxische agenten betrouwbaar te identificeren. De hier gepresenteerde methodologie is nog niet geminiaturiseerd naar een micro well-formaat, waardoor een snellere en efficiëntere screening over een groter doseringsbereik mogelijk is. Als zodanig, in de huidige vorm, de MIFC-gebaseerde in vitro MN assay hier gepresenteerd kan het meest geschikt zijn voor arbeidsintensieve follow-up studies of onderzoek naar goede laboratoriumpraktijken. De methode zal echter nog steeds worden geoptimaliseerd en gevalideerd, en bezit het potentieel om meer flexibiliteit te bieden bij het opsporen van chemische specifieke gebeurtenissen in verband met morfologie, zoals blootstelling aan aneugen die het aandeel van cellen met niet-circulaire kernen die nog steeds scoor bare38. Tot slot biedt de mifc-methode de mogelijkheid om extra biomarkers in de MN-assay (bijv. kinetochoor-kleuring) te introduceren om een uitgebreider beeld te krijgen van het mechanisme van Mn-inductie.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

De auteur dankt Christine Probst (luminex Corporation) voor haar inspanningen bij het ontwikkelen van eerdere vormen van de Data Analysis template, evenals Dr. Haley Pugsley (luminex Corporation) en Dr. Phil Morrissey (luminex Corporation) voor het reviseren en bewerken van de manuscript.

Materials

15 mL centrifuge tube Falcon 352096
Cleanser – Coulter Clenz  Beckman Coulter 8546931 Fill container with 200 mL of Cleanser.  https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/page/itemDetails?itemNumber=8546931#2/10//0/25/1/0/asc/2/8546931///0/1//0/
Colchicine MilliporeSigma 64-86-8
Corning bottle-top vacuum filter  MilliporeSigma CLS430769 0.22 um filter, 500 mL bottle
Cytochalasin B MilliporeSigma 14930-96-2 5 mg bottle
Debubbler – 70% Isopropanol EMD Millipore 1.3704 Fill container with 200 mL of Debubbler.  http://www.emdmillipore.com/US/en/product/2-Propanol-70%25-%28V%2FV%29-0.1-%C2%B5m-filtred,MDA_CHEM-137040?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) MilliporeSigma 67-68-5
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1X EMD Millipore BSS-1006-B PBS Ca++MG++ Free 
Fetal Bovine Serum HyClone SH30071.03
Formaldehyde, 10%, methanol free, Ultra Pure Polysciences, Inc. 04018 This is what is used for the 4% and 1% Formalin. CAUTION: Formalin/Formaldehyde toxic by inhalation and if swallowed.  Irritating to the eyes, respiratory systems and skin.  May cause sensitization by inhalation or skin contact. Risk of serious damage to eyes.  Potential cancer hazard.  http://www.polysciences.com/default/catalog-products/life-sciences/histology-microscopy/fixatives/formaldehydes/formaldehyde-10-methanol-free-pure/
Hoechst 33342 Thermo Fisher H3570 10 mg/mL solution
Mannitol MilliporeSigma 69-65-8
MEM Non-Essential Amino Acids 100X HyClone SH30238.01
MIFC – ImageStreamX Mark II EMD Millipore 100220 A 2 camera ImageStreamX Mark II eqiped with the 405nm, 488nm, and 642nm lasers was used. http://www.emdmillipore.com/US/en/life-science-research/cell-analysis/amnis-imaging-flow-cytometers/imagestreamx-Mark-ii-imaging-flow-cytometer/VaSb.qB.QokAAAFLzRop.zHe,nav?cid=BI-XX-BDS-P-GOOG-FLOW-B325-0006
MIFC analysis software – IDEAS EMD Millipore 100220 The companion software to the MIFC (ImageStreamX MKII)
MIFC software – INSPIRE EMD Millipore 100220 This is the software that runs the MIFC (ImageStreamX MKII)
Mitomycin C MilliporeSigma 50-07-7
NEAA Mixture 100X Lonza BioWhittaker 13-114E
Penicllin/Streptomycin/Glutamine solution 100X Gibco 15070063
Potassium Chloride (KCl) MilliporeSigma P9541
Rinse – Ultrapure water or deionized water NA NA You can use any ultrapure water or deionized water.  Fill container with 900 mL of Rinse.
RNase MilliporeSigma 9001-99-4
RPMI-1640 Medium 1X HyClone SH30027.01
Sheath – PBS EMD Millipore BSS-1006-B This is the same as Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1X  Ca++MG++ free.  Fill container with 900mL of Sheath.
Sterile water HyClone SH30529.01
Sterilizer – 0.4-0.7% Hypochlorite VWR JT9416-1 This is assentually 10% Clorox bleach that can be made by deluting Clorox bleach with water.  Fill container with 200 mL of Sterilzer.
System Calibration Reagent – SpeedBead EMD Millipore 400041 Each tube holds ~10 mL.  https://www.emdmillipore.com/US/en/life-science-research/cell-analysis/amnis-imaging-flow-cytometers/support-training/XDqb.qB.wQMAAAFLBDUp.zHu,nav 
T25 flask Falcon 353109
T75 flask Falcon 353136
TK6 cells MilliporeSigma 95111735
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bonassi, S., et al. An increased micronucleus frequency in peripheral blood lymphocytes predicts the risk of cancer in humans. Carcinogenesis. 28 (3), 625-631 (2007).
  2. Fenech, M. The in vitro micronucleus technique. Mutation Research – Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis. 455 (1-2), 81-95 (2000).
  3. Fenech, M. The Lymphocyte Cytokinesis-Block Micronucleus Cytome Assay and its Application in Radiation Biodosimetry. Health Physics. 98 (2), 234-243 (2010).
  4. Hintzsche, H., et al. Fate of micronuclei and micronucleated cells. Mutation Research – Reviews in Mutation Research. 771, 85-98 (2017).
  5. Fenech, M. The advantages and disadvantages of the cytokinesis-block micronucleus method. Mutation Research. 392 (1-2), 11-18 (1997).
  6. Fenech, M. Cytokinesis-block micronucleus cytome assay. Nature Protocols. 2 (5), 1084-1104 (2007).
  7. Fenech, M., Holland, N., Chang, W. P., Zeiger, E., Bonassi, S. The HUman MicroNucleus Project – An international collaborative study on the use of the micronucleus technique for measuring DNA damage in humans. Mutation Research – Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis. 428 (1-2), 271-283 (1999).
  8. Kirsch-Volders, M., et al. Report from the in vitro micronucleus assay working group. Mutation Research – Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 540 (2), 153-163 (2003).
  9. OECD Library. Test No. 487: In vitro Mammalian Cell Micronucleus Test. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 4. , (2016).
  10. Aardema, M. J., et al. SFTG international collaborative study on in vitro micronucleus test. III. Using CHO cells. Mutation Research – Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 607 (1), 61-87 (2006).
  11. Clare, M. G., et al. SFTG international collaborative study on in vitro micronucleus test. II. Using human lymphocytes. Mutation Research – Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 607 (1), 37-60 (2006).
  12. Lorge, E., et al. SFTG international collaborative study on in vitro micronucleus test. I. General conditions and overall conclusions of the study. Mutation Research – Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 607 (1), 13-36 (2006).
  13. Oliver, J., et al. SFTG international collaborative study on in vitro micronucleus test. V. Using L5178Y cells. Mutation Research – Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 607 (1), 125-152 (2006).
  14. Wakata, A., et al. SFTG international collaborative study on in vitro micronucleus test. IV. Using CHL cells. Mutation Research – Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 607 (1), 88-124 (2006).
  15. Fenech, M., et al. Intra- and inter-laboratory variation in the scoring of micronuclei and nucleoplasmic bridges in binucleated human lymphocytes: Results of an international slide-scoring exercise by the HUMN project. Mutation Research – Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 534 (1-2), 45-64 (2003).
  16. Decordier, I., et al. Automated image analysis of cytokinesis-blocked micronuclei: an adapted protocol and a validated scoring procedure for biomonitoring. Mutagenesis. 24 (1), 85-93 (2009).
  17. Decordier, I., et al. Automated image analysis of micronuclei by IMSTAR for biomonitoring. Mutagenesis. 26 (1), 163-168 (2011).
  18. Schunck, C., Johannes, T., Varga, D., Lorch, T., Plesch, A. New developments in automated cytogenetic imaging: unattended scoring of dicentric chromosomes, micronuclei, single cell gel electrophoresis, and fluorescence signals. Cytogenetic and Genome Research. 104 (1-4), 383-389 (2004).
  19. Rossnerova, A., Spatova, M., Schunck, C., Sram, R. J. Automated scoring of lymphocyte micronuclei by the MetaSystems Metafer image cytometry system and its application in studies of human mutagen sensitivity and biodosimetry of genotoxin exposure. Mutagenesis. 26 (1), 169-175 (2011).
  20. Nüsse, M., Marx, K. Flow cytometric analysis of micronuclei in cell cultures and human lymphocytes: Advantages and disadvantages. Mutation Research – Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 392 (1-2), 109-115 (1997).
  21. Avlasevich, S. L., Bryce, S. M., Cairns, S. E., Dertinger, S. D. In vitro micronucleus scoring by flow cytometry: Differential staining of micronuclei versus apoptotic and necrotic chromatin enhances assay reliability. Environmental and Molecular Mutagenesis. 47 (1), 56-66 (2006).
  22. Bryce, S. M., Bemis, J. C., Avlasevich, S. L., Dertinger, S. D. In vitro micronucleus assay scored by flow cytometry provides a comprehensive evaluation of cytogenetic damage and cytotoxicity. Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 630 (1-2), 78-91 (2007).
  23. Bryce, S. M., et al. Flow cytometric 96-well microplate-based in vitro micronucleus assay with human TK6 cells: Protocol optimization and transferability assessment. Environmental and Molecular Mutagenesis. 54 (3), 180-194 (2013).
  24. Fenech, M. Commentary on the SFTG international collaborative study on the in vitro micronucleus test: to Cyt-B or not to Cyt-B. Mutation Research. 607 (1), 9-12 (2006).
  25. Basiji, D. A. . Methods in Molecular Biology. 1389, 13-21 (2016).
  26. Rodrigues, M. A., Beaton-Green, L. A., Kutzner, B. C., Wilkins, R. C. Automated analysis of the cytokinesis-block micronucleus assay for radiation biodosimetry using imaging flow cytometry. Radiation and Environmental Biophysics. 53 (2), 273-282 (2014).
  27. Rodrigues, M. A., Beaton-Green, L. A., Kutzner, B. C., Wilkins, R. C. Multi-parameter dose estimations in radiation biodosimetry using the automated cytokinesis-block micronucleus assay with imaging flow cytometry. Cytometry Part A. 85 (10), 883-893 (2014).
  28. Rodrigues, M. A., Beaton-Green, L. A., Wilkins, R. C. Validation of the cytokinesis-block micronucleus assay using imaging flow cytometry for high throughput radiation biodosimetry. Health Physics. 110 (1), 29-36 (2016).
  29. Rodrigues, M. A., Probst, C. E., Beaton-Green, L. A., Wilkins, R. C. Optimized automated data analysis for the cytokinesis-block micronucleus assay using imaging flow cytometry for high throughput radiation biodosimetry. Cytometry Part A. 89 (7), 653-662 (2016).
  30. Rodrigues, M. A., Probst, C. E., Beaton-Green, L. A., Wilkins, R. C. The effect of an optimized imaging flow cytometry analysis template on sample throughput in the reduced culture cytokinesis-block micronucleus assay. Radiation Protection Dosimetry. 172 (1-3), 223-229 (2016).
  31. Wang, Q., et al. Automated Triage Radiation Biodosimetry: Integrating Imaging Flow Cytometry with High-Throughput Robotics to Perform the Cytokinesis-Block Micronucleus Assay. Radiation Research. 191 (4), 342-351 (2019).
  32. Rodrigues, M. A. Automation Of The In vitro Micronucleus Assay Using The ImageStream® Imaging Flow Cytometer. Cytometry Part A. 93, 706-726 (2018).
  33. Rodrigues, M. A., Beaton-Green, L. A., Wilkins, R. C., Fenech, M. F. The potential for complete automated scoring of the cytokinesis block micronucleus cytome assay using imaging flow cytometry. Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 836, 53-64 (2018).
  34. Fenech, M., et al. HUMN project: Detailed description of the scoring criteria for the cytokinesis-block micronucleus assay using isolated human lymphocyte cultures. Mutation Research – Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 534 (1-2), 65-75 (2003).
  35. Verma, J. R., et al. Evaluation of the automated MicroFlow® and Metafer™ platforms for high-throughput micronucleus scoring and dose response analysis in human lymphoblastoid TK6 cells. Archives of Toxicology. 91 (7), 2689-2698 (2017).
  36. Fenech, M., et al. HUMN project initiative and review of validation, quality control and prospects for further development of automated micronucleus assays using image cytometry systems. International Journal of Hygiene and Environmental Health. 216 (5), 541-552 (2013).
  37. Kirkland, D., et al. Updated recommended lists of genotoxic and non-genotoxic chemicals for assessment of the performance of new or improved genotoxicity tests. Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 795, 7-30 (2016).
  38. Verma, J. R., et al. Investigating FlowSight® imaging flow cytometry as a platform to assess chemically induced micronuclei using human lymphoblastoid cells in vitro. Mutagenesis. 33 (4), 283-289 (2018).

Tags

In Vitro Micronucleus AssayMultispectral Imaging Flow CytometryAutomated MethodGenotoxicityCytotoxicityClastogensAneugensCell ExposureCytochalasin BPotassium ChlorideFormalinHoechst 33342High-throughputAutomated MicroscopyConventional Flow Cytometry

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Rodrigues, M. A. An Automated Method to Perform The In Vitro Micronucleus Assay using Multispectral Imaging Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (147), e59324, doi:10.3791/59324 (2019).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image