Enzymatische Stabilität durch isothermen Titration Kalorimetrie Messung
Summary
Die thermische Stabilität der Enzym-Aktivität wird leicht durch isothermen Titration Kalorimetrie (ITC) gemessen. Die meisten Protein Stabilität Assays derzeit verwendet Maßnahme Protein entfaltet, aber keine Informationen über enzymatische Aktivität. ITC ermöglicht die direkte Bestimmung der Wirkung des Enzyms Modifikationen auf die Stabilität der Enzym-Aktivität.
Abstract
Diese Arbeit zeigt eine neue Methode zur Messung der Stabilität der Enzymaktivität durch isothermen Titration Kalorimetrie (ITC). Der Gipfel Wärmerate nach eine einzige Injektion der Substrat-Lösung in eine Enzymlösung mit Enzym-Aktivität korreliert ist zu beobachten. Mehrere Injektionen des Substrates in das gleiche Enzym-Lösung im Laufe der Zeit zeigen den Verlust der Enzymaktivität. Der Test ist autonom, erfordert sehr wenig Personal Zeit und ist für die meisten Medien und Enzyme.
Introduction
Enzyme sind Proteine, die in der Lage, eine breite Palette von organischen Reaktionen katalysieren. Die meisten Enzyme Funktion in wässriger Lösung an in der Nähe von neutralen pH-Wert, wodurch den Einsatz von harten Lösungsmitteln. Wegen der hohen Selektivität, katalysierten Enzymreaktionen produzieren weniger (in einigen Fällen keine Nebenprodukte) Nebenprodukte als nicht-selektive Katalysatoren wie Säuren und Laugen1. Dies ist besonders relevant in der Lebensmittel verarbeitenden wo alle chemische Reaktionen durchgeführt werden müssen, so dass das Endprodukt für den menschlichen Verzehr unbedenklich ist. Derzeit werden Enzyme verwendet, um hohen Fructose Corn Sirup2, Käse3, Bier4, laktosefreie Milch5und andere wichtige Nahrungsmittel zu produzieren. Während dieser Arbeit konzentriert sich auf Enzym-Einsatz in der Lebensmittelindustrie, gibt es viele andere Verwendungen für Enzyme, die unter anderem in grüne Chemie und Drogen-Synthese.
Das Dienstprogramm von Enzymen ist begrenzt durch die Stabilität der Enzym-Aktivität, die Aufrechterhaltung der dreidimensionalen Struktur des Enzyms abhängt. Die Enzymstruktur kann durch Modifikationen wie Pegylierung6, Immobilisierung auf eine solide Unterstützung7, gentechnische Veränderungen8und Formulierungen stabilisiert werden. Derzeit Enzymstabilität bemisst sich in der Regel durch differential scanning-Kalorimetrie (DSC) und Endpunkt Enzymaktivität assays9. DSC misst die Temperatur, bei der ein Enzym entfaltet; Je höher die Temperatur, desto stabiler ist die Struktur. Verlust der Aktivität tritt jedoch oft bei einer niedrigeren Temperatur als erforderlich, um das Enzym oder Domänen innerhalb der Enzym-10entfalten. DSC ist daher nicht ausreichend, um festzustellen, ob eine Änderung des Enzyms die Stabilität der Enzym-Aktivität erhöht. Endpunkt-Enzym-Assays sind in der Regel Zeit intensiv, erfordern mehrere Proben und beinhalten oft eine gekoppelte kolorimetrischen Reaktion, die auf stark farbigen oder opak Lösungen oder Suspensionen nicht anwendbar ist.
Diese Arbeit zeigt eine Methode zur direkten Messung der Stabilität der Enzymaktivität durch isothermen Titration Kalorimetrie (ITC). ITC misst die Geschwindigkeit von Wärme freigesetzt oder aufgenommen im Verlauf einer Reaktion. Da fast alle Reaktionen produzieren oder Wärme absorbieren, kann ITC verwendet werden, für die meisten Enzym-katalysierten Reaktionen, einschließlich der Reaktionen, die nicht über eine gekoppelte Reaktion oder auftreten in undurchsichtigen Medien wie Milch. ITC seit vielen Jahrzehnten verwendet wurde, um chemische kinetische Parameter für viele Arten von Reaktionen zu messen, aber das Protokoll hier vorgestellten mit ITC um zu messen, die Spitze Wärmerate von Enzym-katalysierten Reaktionen im Mittelpunkt und zeigt, dass Enzymaktivität linear mit der Spitze Wärmerate korreliert. ITC Messungen von Peak-Hitze-Preise sind meist autonom und benötigen sehr wenig Personal Zeit einzurichten und zu analysieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Automatisierung ist ein großer Vorteil des ITC Enzym Stabilität Tests hier beschrieben. Sobald die entsprechende Puffer und Lösungen vorgenommen werden, wird die Rüstzeit für jedes Assay ca. 15 min für die Person, die den Assay. Im Gegensatz dazu die konventionellen Assays für die Invertase und Laktase-Aktivität erfordern ca. 2 h mit kontinuierlichen Beteiligung von der Person, die die Probe und viele enzymatische Aktivität Assays nehmen wesentlich mehr Personenstunden. In einer früheren Publikation haben wir g…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
nichts
Materials
| a-Lactose | Fisher Scientific | unknown (too old) | 500g |
| Sodium Acetate, Anhydrous 99% min | Alfa Aesar | A13184-30 | 250g |
| Lactase | MP Bio | 100780 | 5g |
| Hydrocholric Acid Solution, 1N | Fisher Scientific | SA48-500 | 500mL |
| Benchtop Meter- pH | VWR | 89231-622 | |
| Ethanol 70% | Fisher Scientific | BP8231GAL | 1gallon |
| Micro-90 | Fisher Scientific | NC024628 | 1L (cleaning solution) |
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