قياس الاستقرار الانزيمية بالقياس متحاور المعايرة
Summary
ويقاس الثبات الحراري لنشاط إنزيم سهولة بمعايرة متحاور القياس (ITC). معظم فحوصات الاستقرار البروتين المستخدمة في قياس البروتين التي تتكشف حاليا، ولكن لا توفر معلومات حول النشاط الأنزيمي. مركز التجارة الدولية يتيح التصميم مباشرة أثر التعديلات الإنزيم على الاستقرار نشاط الإنزيم.
Abstract
ويوضح هذا العمل أسلوب جديد لقياس استقرار نشاط إنزيم بمعايرة متحاور القياس (مركز التجارة الدولية). ذروة الحرارة المعدل الملاحظ بعد حقنه واحدة من الحل الركيزة في حل إنزيم يرتبط بنشاط إنزيم. إظهار حقنات متعددة من الركازة إلى نفس الحل الإنزيم مع مرور الوقت الخسارة في نشاط إنزيم. المقايسة المتمتعة بالحكم الذاتي، التي تتطلب القليل جداً من وقت الموظفين، وهو ينطبق على معظم وسائل الإعلام والأنزيمات.
Introduction
الإنزيمات بروتينات قادرة على حفز مجموعة واسعة من التفاعلات العضوية. معظم الإنزيمات الدالة في محلول مائي في القرب من الأس الهيدروجيني محايدة وبالتالي تجنب استخدام المذيبات قاسية. وبسبب هذه الانتقائية العالية، إنتاج إنزيم حفزت ردود الفعل أقل (في بعض الحالات لا تركات) تركات من محفزات غير انتقائية مثل الأحماض والقواعد1. وهذا مهم خصوصا في تصنيع الأغذية ويجب أن يتم فيها جميع التفاعلات الكيميائية حتى المنتج النهائي آمنة للاستهلاك البشري. حاليا، والأنزيمات تستخدم لإنتاج ارتفاع سكر الفواكه عصير الذرة2والجبن3، البيرة4، الحليب الخالي من اللاكتوز5، وغيرها من المنتجات الغذائية الهامة. بينما تركز هذه الورقة على استخدام إنزيم في صناعة المواد الغذائية، وهناك العديد من الاستخدامات الأخرى للإنزيمات بما في ذلك في توليف المخدرات والكيمياء الخضراء.
الأداة المساعدة للإنزيمات محدود باستقرار نشاط الإنزيم، الذي يعتمد على الحفاظ على هيكل ثلاثي الأبعاد للانزيم. يمكن أن تستقر بنية الإنزيم التعديلات مثل بيجيليشن6، والتثبيت على دعم قوي7والتعديلات الوراثية8والصياغات. حاليا استقرار الإنزيم يقاس عادة بالقياس المسح التفاضلي (DSC)، ونشاط إنزيم نقطة النهاية فحوصات9. DSC يقيس درجة الحرارة التي تتكشف إنزيم؛ ارتفاع درجة الحرارة، الأكثر استقرارا في الهيكل. ومع ذلك، غالباً ما يحدث فقدان النشاط عند درجة حرارة أقل مما هو مطلوب تتكشف إنزيم أو المجالات داخل الإنزيم10. ولذلك، DSC ليس كافياً لتحديد ما إذا كان تعديل إنزيم يزيد من استقرار نشاط إنزيم. فحوصات إنزيم نقطة النهاية هي عادة الوقت مكثفة، وتتطلب عينات متعددة، وغالباً ما تنطوي على رد فعل اللونية إلى جانب أن هذا لا ينطبق على الحلول عالية الملونة أو مبهمة أو تعليق.
يوضح هذا العمل وسيلة لقياس مباشر لاستقرار نشاط إنزيم بمعايرة متحاور القياس (مركز التجارة الدولية). مركز التجارة الدولية يقيس معدل الحرارة الإفراج أو استيعابها وأثناء رد فعل. منذ ما يقرب من جميع ردود الفعل إنتاج أو امتصاص الحرارة، يمكن استخدام المركز لمعظم الإنزيم حفزت ردود الفعل، بما في ذلك ردود الفعل التي لا يكون لها رد فعل يزوج أو تحدث في وسائل الإعلام مبهمة مثل الحليب. مركز التجارة الدولية وقد استخدمت لعقود عديدة لقياس البارامترات الحركية الكيميائية لأنواع كثيرة من ردود الفعل، ولكن البروتوكول المعروضة هنا يركز على استخدام المركز لقياس معدل الحرارة الذروة لحفز إنزيم ردود الفعل ويدل على أن نشاط إنزيم خطيا يرتبط بمعدل الحرارة القصوى. مركز التجارة الدولية إجراء قياسات لمعدلات الحرارة القصوى هي في معظمها المتمتعة بالحكم الذاتي وتتطلب القليل جداً من وقت الموظفين لإعداد وتحليل.
Protocol
Representative Results
Discussion
ميزة رئيسية للمقايسة الاستقرار إنزيم المركز الموصوفة هنا هو التشغيل الآلي للمكاتب. حالما يتم إجراء كافة المخازن المؤقتة الملائمة والحلول، وقت الإعداد لكل فحص حوالي 15 دقيقة للشخص الذي يقوم الفحص. على النقيض من ذلك، تتطلب فحوصات التقليدية للنشاط invertase واللاكتاز حوالي 2 ح مع مشاركة مستمرة م?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
لا شيء
Materials
| a-Lactose | Fisher Scientific | unknown (too old) | 500g |
| Sodium Acetate, Anhydrous 99% min | Alfa Aesar | A13184-30 | 250g |
| Lactase | MP Bio | 100780 | 5g |
| Hydrocholric Acid Solution, 1N | Fisher Scientific | SA48-500 | 500mL |
| Benchtop Meter- pH | VWR | 89231-622 | |
| Ethanol 70% | Fisher Scientific | BP8231GAL | 1gallon |
| Micro-90 | Fisher Scientific | NC024628 | 1L (cleaning solution) |
References
- Anastas, P., Eghbali, N. Green chemistry: principles and practice. Chemical Society Reviews. 39 (1), 301-312 (2010).
- Jin, L. Q., et al. Immobilization of Recombinant Glucose Isomerase for Efficient Production of High Fructose Corn Syrup. Applied Biochemistry Biotechnoiogy. 183 (1), 293-306 (2017).
- Budak, &. #. 3. 5. 0. ;. &. #. 2. 1. 4. ;., Koçak, C., Bron, P. A., de Vries, R. P. . Microbial Cultures and Enzymes Dairy Technology. , 182-203 (2018).
- van Donkelaar, L. H. G., Mostert, J., Zisopoulos, F. K., Boom, R. M., van der Goot, A. J. The use of enzymes for beer brewing: Thermodynamic comparison on resource use. Energy. 115, 519-527 (2016).
- Rodriguez-Colinas, B., Fernandez-Arrojo, L., Ballesteros, A. O., Plou, F. J. Galactooligosaccharides formation during enzymatic hydrolysis of lactose: Towards a prebiotic-enriched milk. Food Chemistry. 145, 388-394 (2014).
- Lawrence, P. B., Price, J. L. How PEGylation influences protein conformational stability. Current Opinions in Chemical Biology. 34, 88-94 (2016).
- Bernal, C., Rodriguez, K., Martinez, R. Integrating enzyme immobilization and protein engineering: An alternative path for the development of novel and improved industrial biocatalysts. Biotechnology Advances. 36 (5), 1470-1480 (2018).
- Rigoldi, F., Donini, S., Redaelli, A., Parisini, E., Gautieri, A. Review: Engineering of thermostable enzymes for industrial applications. Applied Bioengeneering. 2 (1), 011501 (2018).
- Johnson, C. M. Differential scanning calorimetry as a tool for protein folding and stability. Archives of Biochemistry and Biophysics. 531 (1), 100-109 (2013).
- Chen, N. G., Gregory, K., Sun, Y., Golovlev, V. Transient model of thermal deactivation of enzymes. Biochimica et biophysica acta. 1814 (10), 1318-1324 (2011).
- Mason, M., et al. Calorimetric Methods for Measuring Stability and Reusability of Membrane Immobilized Enzymes. Jounal of Food Science. , (2017).
- Leksmono, C. S., et al. Measuring Lactase Enzymatic Activity in the Teaching Lab. Journal of visualized experiments : Journal of Visual Experiments. (138), e54377 (2018).
