JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
生物化学

Гибридный ясный/синий родной электрофорез для разделения и анализа митохондриальных Сверхкомплексов дыхательной цепи

Published: May 19, 2019
doi:
10.3791/59294
,
1Interdisciplinary School of Health Science, Faculty of Health Sciences and Department of Cellular and Molecular Medicine, Faculty of Medicine,University of Ottawa

Summary

Здесь мы представляем протокол для извлечения, разрешения и идентификации митохондриальных суперкомплексов, что сводит к минимуму воздействие моющих средств и Coomassie Blue. Этот протокол предлагает оптимальный баланс между разрешением и сохранением активности фермента, при этом сводя к минимуму риск потери лабильных белков-белковых взаимодействий.

Abstract

Комплексы окислительного фосфорилирования образуют супрамолекулярно-белковые аранжировки, названные суперкомплексами (СКС), которые, как полагают, наделяют митохондрии структурными и функциональными преимуществами. СКС были определены во многих видов, от дрожжей до млекопитающих, и все большее число исследований докладе нарушения их организации в генетических и приобретенных заболеваний человека. В результате все большее число лабораторий заинтересовано в анализе СКС, что может быть методологически сложным. Эта статья представляет оптимизированный протокол, который сочетает в себе преимущества Blue-и Clear-родные методы PAGE для решения и анализа СКС в сроки эффективным образом. С помощью этого гибридного метода CN/BN-PAGE Митохондриальные СКС, извлеченные из оптимального количества мягкого моющего средства, подвергаются кратковременному воздействию анионного красителя Blue (CB) в начале электрофореза, без воздействия других моющих средств. Это короткое воздействие CB позволяет отделить и решить СКС так же эффективно, как с традиционными BN-PAGE методы, избегая при этом негативное влияние высоких уровней CB на в-гель деятельности исследования, и лабильных белков белка взаимодействий в СКС. С помощью этого протокола, таким образом, можно сочетать точные и быстрые измерения активности геля с аналитическими методами с участием 2D электрофорез, иммуно-обнаружение, и/или протеомика для продвинутого анализа СКС.

Introduction

Митохондрии вырабатывают энергию через окислительное фосфорилирование, где дыхательные комплексы I-II-III-IV окисляют субстраты и переносят электроны в кислород, создавая градиент, который позволяет фосфорилирование АДФ по СПС синтаза (CV). В последние годы обширные исследования показали, что дыхательные комплексы не только в линейном виде включены в внутреннюю митохондриальную мембрану, но также организованы в суперкомплексы (СКС)1,2. В митохондриях митохондрии, ЦС существуют в различных стойкометох: CI/CIII2/ципс1-4 (который назван респирасосом, и который способен NADH: O2 оксидацион в ПРОБИРКЕ)2, CI/CIII2, и CIII2 /P21-23,4. Кроме того, дыхательные комплексы распределяются по разным соотношениях между их свободной формой и механизмами СКС. Таким образом, по оценкам, 85%-100% CI, 55%-65% CIII, и 15%-25% ЦИВ находятся в ГКС4. Считается, что эти супрамолекулярные структуры снижают производство ROS, стабилизируют или помогают в сборке индивидуальных комплексов, регулируют деятельность дыхательной цепи и предотвращают агрегацию белка в богатой внутренней митохондриальной мембране, которая5 ,6,7,8. Их Ремоделирование при изменении спроса на энергию и их значимости в патогенезе заболеваний изучается в нескольких лабораториях3,7,9,10, 11 , 12 , 13 , 14. исследования показали, что патологические изменения в сборке СКС присутствуют в различных расстройствах, включая, но не ограничиваясь этим, генетический дефект в Кардиолипин синтез15, сердечная недостаточность16, в-репертуаре17, диабет12, и старение18.

Родной электрофорез и иммунообнаружение широко используются в исследованиях СКС для решения oxфос комплексов четвертичных договоренностей2,19,20,21. Родной электрофорез может быть дополнительно совмещен с конкретными в гелевых действиях или на странице 2D-СДЗ, чтобы обеспечить точное молекулярное определение различных сборок1,19. Способность к изучению СКС в решающей степени зависит от условий извлечения, включая тип и концентрацию моющего средства, ионной прочности и рН, а также на электрофлефотических условиях миграции, которые состоят из буферного состава, наличия ЦБ, геля размер, и акриламида процент2.

Протоколы и резолюции группы МСК значительно различаются между документами, что делает сравнение между исследованиями трудным и адаптации методов, бросающей вызов22. Таким образом, этот документ предлагает надежный и оптимальный протокол для извлечения ГТИ из изолированных митохондрий различных источников с неионного моющего средства, и для решения высокой молекулярной массы ГТС полос. Оптимизированная концентрация моющих средств, состав буфера экстракции и отсутствие Комасси Блю в подготовке образцов минимизируют разрушение белковых комплексов. Этот протокол (см. диаграмму 1 для обзора) сочетает в себе CN-Page и BN-Page для оптимального разрешения СБК сборки на большой гель, и совместим с в гель деятельности исследования, позволяющие лучше визуализации реактивных полос, наряду с использованием иммунообнаружение для детального анализа договоренностей и состава.

Protocol

1. Удаление SC Подготовьте 100 мл буфера извлечения (см. таблицу 2) путем растворения ЭДТА в воде. Увеличьте рН с Кох до полного растворения, затем отрегулируйте рН до 7,5 с совместимого. Добавьте оставшиеся компоненты в раствор, завершите до конечного тома водой и продолжайте лед. В трубке Растворите дигинин в буфере извлечения, чтобы сделать 10%-ное решение, вортекс тщательно, пока полностью не растворится, и держать на льду.Примечание: извлечение буфер может быть подготовлен заранее и хранится при температуре 4 ° c в течение 2 месяцев максимум. Если волнистые полосы начинают появляться в нижней части геля, это означает, что извлечение буфера слишком стар. При подготовке 10%-ного решения, подготовьте объем запасов, подсчитывая 500 мкл за образец при использовании митохондрий печени мыши. Растворимость в дигонине варьируется в зависимости от происхождения и количества продукта (см. таблицу материалов). Митохондрии изолированы от животной ткани (мышь сердце, мышца, печень; крысиное сердце) или клетки (человеческий фибровзрыв) с использованием стандартных протоколов23,24,25 могут быть использованы для извлечения СКС. После получения митохондрий, количественно содержание белка, используя бицин-миновой кислоты анализ комплекта в соответствии с рекомендациями производителя. Дополнение изолированных митохондрий с протеаз и ингибиторы фосфоратазы на этом этапе по мере необходимости.Примечание: СКС могут быть извлечены либо из свежих или талых митохондрий. Рекомендуется, чтобы извлечь СКС из всех образцов в то же время, чтобы застраховать их лечат с теми же партиями решений и в тех же условиях. Основываясь на полученной митохондриальной концентрации белка и окончательном соотношении дигинина/белка, следует рассчитать объем запаса дигинина и буфер извлечения, необходимый в соответствии с таблицей 1. Для извлечения из СК, добавьте 1 мкл извлечения буфера (Таблица 2), содержащий дигинин для каждого 10 мкг митохондриального белка. Соотношение дигнин/белок может варьироваться от 2 до 8 г/г. Для каждого нового типа образца (см . Рисунок 2 для примера) следует всегда выполнять “титрование” в виде оцифрования. Гранулы митохондрий, в 1,5 mL трубки центрифугирования на 16 000 x g для 10 мин при температуре 4 °c. Откажитесь от супернаранта и снова приостанавлийте митохондриальную гранулу в вычисляном объеме буфера ледяной экстракции, содержащего дигинин. Поместите трубы на мини-трубку ротатора и инкубировать в течение 30 минут при температуре 4 ° с при средней скорости вращения. Убедитесь, что образцы получают правильно смешанные. Пробы центрифуг на 20 400 x g для 45 мин при температуре 4 °c для удаления нерастворимой фрагменты. Перенесите супернатант в новую трубку на льду и квантифицировать белки. Эта фракция представляет экстракт дыхательных суперкомплексов. Если электрофорез не выполняется в тот же день, Храните образцы при температуре-80 ° c.Примечание: 1) Избегайте замораживания/оттаивания циклов экстракта, так как это нарушает высшие молекулярные механизмы СКС. Aliquot образца до первого цикла замораживания/оттаивания, если это необходимо. 2) для выполнения стандартного эксперимента BN-PAGE к экстракту СКС следует добавить ЦБ на этом шаге. ЦБ должен быть добавлен в соотношении 1g/8g по отношению к количеству используемого моющего средства. 2. градиент гель кастинг и электрофорез Подготовка 3x градиент буфера и акриламида запасов для изготовления градиент гель, aliquot, и хранить при температуре-20 ° c (см. таблицу 3). Подготовьте буферы анода и катода и держите на 4 °C (см. таблицу 5). Откройте кастинную камеру и поместите наружную стеклянную пластинку (20 см х 22 см) в камеру. Установите один набор рассаров (1,5 мм) с помощью карты выравнивания, чтобы убедиться, что они крепко сидят в стороне и углах камеры. Поместите внутреннюю стеклянную пластинку (20 см х 20 см) поверх прокладки (это образует гель сэндвич), и положить пластиковый лист разделения на верхней части стеклянной пластины. Повторите шаг 2,3, пока не будет достигнуто желаемое количество гелей. Для этого протокола, 4 гели литье. Система литья камеры, которую мы используем (см. таблицу материалов) позволяет литья максимум 10 гели одновременно. Take-up оставшееся пространство в камере, сначала добавив, как много акриловых блоков по мере необходимости, а затем стеклянные пластины, если это необходимо.Примечание: Монтаж должен быть плотно запечатан; между гелевыми сэндвичами в камере не должно быть места. Поместите полосу парапленки в паз, прежде чем усаживать прокладку твердо на зазубрину прокладки. Поместите уплотнительное блюдо на камеру и затяните все 6 винтов. Стенд литья камеры. Место градиент бывший на перемешать пластины с магнитной мешалкой в “легких” смешивания камеры. Подключите трубопровод литья камеры к градиенту бывший, закрепите трубки в кассете перисталистики насоса, и убедитесь, что стоп-кран градиент бывший закрыт. Для литья 4 гели, подготовить 60 мл 4% и 60 mL из 12% гель решения (см. таблицу 4) в колбе Эрленмайер и вихрем тщательно перемешать. Налейте 60 mL 4% гель раствор в “легких” смесительные камеры, и 60 мл 12% в “тяжелых” водохранилище камеры градиента бывшего. Установите скорость движения перемешать пластины на 350 оборотов в минуту. Откройте стоп-кран и включите насос в 35 оборотов в минуту. После того, как легкая фракция ниже, чем тяжелая фракция, пауза насоса и открыть клапан стволовых между “легких” и “тяжелых” водохранилищ, пусть фракции объем выравниваться, и перезапустить насос.Примечание: важно, что нет пузырьков войти в систему и получить в ловушке между стеклянными пластинами. Если это произойдет, отменить монтаж, мыть и переделывать. После того как градиент гель полностью налил, остановить насос, и наложение воды (около 1 мл) на каждый гель сэндвич для предотвращения высыхания геля. Пусть полимеризации в течение 2 ч. Приготовьте гель для укладки 25 мл в Эрленмейре и тщательно перемешайте. Удалите воду и вставьте 15 хорошо гребни в каждый гель сэндвич. Налейте укладывая гель и дайте полимеризировать для 2 ч.Примечание: гели могут быть литье и хранится при температуре 4 ° c в течение 1 недели. Вставить гель в сэндвич зажимы и удалить гребень. С короткой стеклянной пластиной, облицовкой вниз, вставьте гель-сэндвич в охлаждающий сердечник. Повторите с другой стороны, и поместите ядро в танк электрофорез. Налейте 300 мл голубого катодного буфера во внутреннюю камеру резервуара электрофорез. Налейте 2 л анода буфера в наружной камере электрофорез танк.Примечание: электрод должен быть погружен в Катодный буфер, который требует приблизительно 300 mL. Нагрузка между 75 мкг и 175 мкг белка на хорошо. Запустите гель на 150 V для 1,5 h (или до тех пор, пока образцы не вошли в градиент гель) в холодном помещении (4 ° c).Примечание 1:1) минимум 75 мкг в скважины требуется для хорошего разрешения полос активности в гелевых. Загрузка более 175 мкг белка приведет к потере четких полос из-за чрезмерной активности фермента. 2) реплицирует образца должны быть загружены в отдельных скважин для обеспечения параллельного определения в гелевых деятельности и иммунообмного анализа комплексов OXФОС. Параллельное определение ига для CI, ИСИ, ЦПС и CV требует минимум 300 мкг. при параллельном иммунооблих анализе CI, ИСИ, ИСИ, ЦПС и CV требуется минимум 375 мкг. Удалите синий катод буфер с пипетки или вакуум, заменить на 300 мл сине-свободный Катодный буфер, и запустить гель на 200 V ночь (16-20 ч) в холодном помещении (4 ° c). Перейти к шагу 3 или 4 для измерения активности в гелевых или иммунооблетирования. 3. в-гель деятельности для комплексов I, II, IV и CV Перед окончанием электрофореза, подготовьте в геле буферные активности в соответствии с таблицей 6, и держать в ТЕМНОТЕ на RT. 20 мл буфера активности в гель достаточно для 3 полос образца.Примечание: Этот анализ активности CV в гелевой основе основывается на обратной активности Атфнтраза (т.е. АТФ-гидролиза) и использует кальций в качестве софактора, который осаждает гель. Кальций менее вреден, чем свинец, используемый в других протоколах. Кроме того, использование этого протокола не требует предварительной активации/кондиционирования геля23. Остановите электрофорез и заберите гель. Срезанные дорожки, при необходимости, и передача геля полос в полиэтиленовых пакетах (3 стороны вырезать, и полиэтиленовый пакет открыт как книга). Печать 2 из 3 сторон с термоуплотнитель.Примечание: чтобы сравнить состав SC полос между экспериментальными группами, рекомендуется запускать те же образцы в реплицирует на тот же гель. Срезанные полосы для инкубирования каждой репликации в различных буферов активности в гелевых (CI, II, IV, V). Чтобы подтвердить специфичность анализов, дополнительные реплициты могут быть подготовлены для работы в гелевых действиях в присутствии определенных ингибиторов дыхательной цепи. Для 3 экспериментальных образцов (т. е. 3 скважины) добавьте 20 мл буфера активности в геле, удалите пузырьки и запечатайте 4-ю сторону полиэтиленовый пакет.Примечание: Добавление ингибиторов в отрицательных экспериментах по контролю при исполнении: CI: Rotenone 1 мкм; ИСИ: натрий Malonate 10 мм; CIII: Антимицин-8 мкм; В: КCN 0,6 mM; CV: Ололиомицин 0,5 мкм. Инкубируйте полосы геля при температуре 37 °C в темноте и проверяйте каждые 15 мин. время инкубации варьируется в зависимости от количества белка и комплексов. CI будет реагировать быстрее, чем в или CV. оптимальное окрашивание обычно происходит после 2 ч для CI, 4 ч для и 6 ч для ИСИ и CV. Промыть гелевые дорожки в воде, чтобы остановить реакцию, и изображение на белом фоне для CI, ИСИ, или черный фон для CV.Примечание: гели могут храниться в пластиковых пакетах на RT или 4 °C в течение нескольких месяцев. 4. иммунооблотинг Подготовьте буфер переноса в соответствии с таблицей 7и храните в RT. Подготовьте ТБСТ и храните в рт. Поместите весь гель, или выбранных полос, в контейнере и добавить буферный буфер дополнена СДД (0,25% окончательный в передаче буфера). Поместите контейнер на рокер и инкубировать в течение 1 ч. Вырезать ПВХ мембраны (размер, соответствующий размеру геля) и активировать в 20 мл метанола под агитацией в течение 2 мин. Замените 20 мл буфером и поместите под агитацию на 2 мин. Подготовка передачи сэндвич, снизу вверх, убедившись, что нет пузыря между гелем и активированный ПВХ мембраны: ясная сторона кассеты/черная Губка/промокательной бумаги/мембраны/гель/промокательной бумаги/черная Губка/Черная сторона кассеты. Закройте и заприте кассету. Место Трансфер бутерброд в передаче танк, с четкой стороны сэндвич перед красной стороной электрода, и залить Трансфер буфер для погружения геля. Подключите систему охлаждения к цистерне и установите при температуре 4 °C. Подключение к энергоснабжение, установленных на 40 mA, и запустить в течение 24 ч. Извлечение мембран, блок для 1 ч в 5% БСА в ТБСТ, и инкубировать в первичных антител решение подготовлено в 5% БСА в ТБСТ ночь на 4 ° c.Примечание: см. таблицу 8 для используемых антител. Промыть мембраны в ТГСТ 3x за 10 мин каждый. Инкубировать мембраны в вторичных растворах антител, подготовленных в 5% БСА в ТБСТ для 2 ч при комнатной температуре. Промыть мембраны в ТГСТ 3x за 10 мин каждый. Добавьте хемилюлюминесцентное раствор к мембране и изображению. 5. анализ В гель деятельность анализа изображений или иммунооблоты могут быть использованы для анализа СКС. Для анализа композиции полос, выровнять реплицирует и проверить, какой комплекс положительно отреагировал на каждой данной группы. Для анализа распределения комплексов, в различных супрамолекулярных сборок, открытые изображения в Iiiej и использовать инструмент анализа геля (см. Рисунок 5 для примера). Выберите полосы с помощью инструмента прямоугольника и полос движения. Нарисуйте линии, чтобы закрыть область под кривой каждой группы интересов и нажмите на каждой области с палочкой инструмент для создания таблицы, содержащей площадь под кривой значений. Чтобы вычислить распределение комплекса, сообщите значения для каждой группы относительно мономера.

Representative Results

На рисунке 2 показаны результаты эксперимента по титрации, направленного на выявление надлежащего количества дигинина, необходимого для извлечения СКС. Эта сумма будет варьироваться в зависимости от типа ткани/ячейки и был ли образец заморожен или нет. Для этого эксперимента была проведена активность в гелевых, чтобы визуализировать МСК, изолированные от свежей митохондрии печени мыши. Были протестированы коэффициенты от 2/1 до 10/1 г./г белка. Оптимальное количество гистонина для данного образца составляет 4 г/г, так как обеспечивает хорошее разрешение мономерные и высокомолекулярные ГТС. При более низком соотношении диапазоны не ясны и не разрешаются в мазке во время электрофореза, в то время как использование более высокого соотношения дигинина приводит к нарушению высокого молекулярного веса SC. На рисунке 3 и рисунке 4 приведены результаты полного эксперимента, который выполняется на основе подготовки митохондрий печени мыши, полученных с помощью 4 г белка/г. Белки были разделены с использованием гибридных BN/CN-PAGE, Стандартный BN-PAGE, или CN-PAGE. Все три гели были литье в то же время и полос были загружены с реплицирует же образца. После электрофореза отдельные полосы были разрезаны и обработаны для измерения активности геля (CI, ИСИ, ЦИВ и CV на рисунке 3) и иммунооблетирования (CI, ИСИ, CIII, ТПС, CV на рисунке 4). Добавление CB либо на мгновение в катодной буфер (т.е. гибридный CN/BN-PAGE) или в образце и катодной буфер на протяжении электрофорез (т. е.-PAGE), значительно улучшает мобильность и разрешение полос SC, и отдельных дыхательных комплексов по сравнению с CN-PAGE (рис. 3). Диапазоны легко различимы с гибридной техникой или БН-страницей после того, как активность в гелевых реакционной мощности для, в то время как в той же выборке, разрешенных CN-PAGE, СКС и мономерные реактивные полосы не могут быть идентифицированы. На рисунке 3 и рисунке 4 показано, что схема разрешения и диапазонов окфосс мономеров и супрамолекулярных сборок качественно СОПОСТАВИМА между гибридным CN/BN-PAGE и BN-Page. Однако существуют заметные различия. Во-первых, электрофонная мобильность комплексов ОКФОС несколько снижается, когда белки разделяются с использованием гибридных условий CN/BN-PAGE VS Стандартный BN-Page, в связи с уменьшенным количеством ЦБ. Этот сдвиг мобильности больше для мономеров, а затем CV мономеров, и CI (рис.3 и рис. 4). Во-вторых, синий фон ниже в гибридных CN/BN-PAGE по сравнению с BN-PAGE (рис. 3, левые полосы). В результате, высокие фоновые уровни после BN-PAGE полностью маскирует окрашивание в гель активности для ИСИ, и усиливает фоновый шум, связанный с активностью димеров (рис.3). В-третьих, активность CV выше, когда образцы запускаются под гибридным CN/BN-PAGE условиях по сравнению с BN-PAGE (рис. 3), в связи с уменьшенным количеством ЦБ, который, как известно, вмешиваться в CV каталитической деятельности. 26 CN/BN-Page также позволяет лучше сохранить CV супрамолекулярных сборок, как показано на большей части общей активности CV, связанные с димеров CV (рис.3). Кроме того, на CN/BN-PAGE отображаются олигомеры CV, в то время как они полностью диссоциированные в условиях BN-PAGE. Интересно, что отдельные группы отображения CV деятельности также наблюдаются между CV мономеров и димеров, когда образцы работают под CN/BN-PAGE (рис. 2). На рисунке 5 показан репрезентативный анализ комплексного распределения окфос в супрамолекулярных агрегах. Изображение показывает CI в гелевой активности образцов, полученных из 4 различных здоровых печени мыши митохондрий препаратов. Анализ денситометрии позволяет измерить область под кривой CI-реактивных полос и представить относительное распределение активности С1 в мономерные (I1) и супрамолекулярных формах (i1III2, i1III2IV 1, I1III2IVn). Подобный анализ может быть выполнен после иммунообмного. Рисунок 1: процесс анализа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенном варианте этой фигуры. Рисунок 2: титрование гипотонина для извлечения суперкомплексов из свежей митохондрии печени мыши. Этот пример показывает аликвотов митохондрий мыши печени, изолированные от одного животного, которое лечился с увеличением количества дигинина для извлечения дыхательных суперкомплексов. Затем образцы были разрешены гибридным CN/BN PAGE, и была определена активность в геле. В1: комплекс IV мономеров; 2: сложные ДИМЕРЫ IV; SC: суперкомплексы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенном варианте этой фигуры. Рисунок 3: активность в гелевых комплексах ОКФОС после ГИБРИДНОГО CN/BN-Page, BN-Page или CN-Page. Печень митохондрии изолированы от одной мыши лечили с помощью Ги, (4 g/g соотношение диготонин/белка) для извлечения дыхательных суперкомплексов. Аликуты этого образца были загружены на несколько скважин в трех различных гелях и представлены в CN/BN-PAGE, BN-PAGE или CN-PAGE. Каждая репликация в каждом геле была затем вырезана и сразу использовалась для анализов активности в гелевых (помечены CI, ИСИ, циг и CV). Один переулок был использован в качестве элемента управления, чтобы показать фона (помечены BG) окрашивание с Coomassie Blue. Комплексы OXФОС и супрамолекулярные агрегаты идентифицируются с использованием стандартной номенклатуры, с цифрами в индексах, указывающими молекулярную стоиметрию каждого комплекса ОКФС. Следует отметить, что позиция супрамолекулярных сборок, содержащих CIII, основывается на иммунообнаружении, так как в данном эксперименте не выполнялась деятельность в области геле для CIII. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенном варианте этой фигуры. Рисунок 4: Иммунооблот анализа комплексов окфос после ГИБРИДНОЙ CN/BN-Page или BN-Page. Реплицирует из экспериментов, описанных в рисунке 3 легенда были электро-переданы на одной мембране. После переноса отдельные полосы были разрезаны и инкубированы специфическими антителами, признающими CI, ИСИ, CIII, циг и CV. комплексы ОКФОС и супрамолекулярно-массовых агрегатов идентифицируются с использованием стандартной номенклатуры, с цифрами в индексах, указывающими Молекулярная стоиметрия каждого комплекса ОКФС. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенном варианте этой фигуры. Диаграмма 5: количественная оценка распределения CI в мономерческих и супрамолекулярных собраниях. (A) CI в-гель деятельности определяется следующие гибридные CN/BN-Page в печени МИТОХОНДРИЙ SC экстракты получены из 4 мышей. B) денцтограммы, полученные при помощи геля для анализа изображений, показывающих различные пики, соответствующие CI мономерам (i1) и различным CI-содержащих супрамолекулярных комплексов (i1III2, i1III2IV1 , и I1III2IVn). C) количественное определение относительного распределения активности С1. Данные представляют собой среднее и сем из 4 мышей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенном варианте этой фигуры. Соотношение дикинина/белка (г/г) 2 г/г 4 г/г 6 г/г 8 г/г Объем буферного извлечения (мкл) 400 300 200 100 10%-ный запас дигонина (мкл) 100 200 300 400 Общий объём буферного извлечения (мкл) 500 500 500 500 Таблица 1: объемы, необходимые для извлечения ГТС из 5 мг митохондриальных белков с использованием различных коэффициентов дигинина/белка. Составной Окончательная концентрация ЭДТА, pH 7,5 1 мм в HEPES 30 мм в Ацетат калия 150 мм Глицерин 12 6-аинопрововая кислота 2 мм в Таблица 2: буфер экстракции SC (окончательные концентрации). Хранить при температуре 4 °C максимум 3 месяца. Составной Окончательная концентрация 3x гель буфер: Aliquot и держать на-20 ° c, pH 7,5 Имидазол/совместный рН-7,0 75 мм 6-аинопрововая кислота 1,5 м в Буфер акриламида: Aliquot и держать на-20 °c Акриламида 99,5% Бис-акриламида 3 Таблица 3: буферы запаса геля. Для 2 гелей: 4% (60 мл) 12% (60 mL) Укладка (4%) (25 мл) 3X гель буфер 19,8 мл 19,8 мл 8,25 мл Акриламида буфер 4,8 мл 14,4 мл 2 мл H2O 35 мл 13,1 мл 14,6 мл Глицерин – 12 мл – APS 10% 360 мкл 60 мкл 150 мкл TEMED 24 мкл 12 мкл 10 мкл Таблица 4:4%-12% градиент геля. Составной Окончательная концентрация Анод буфер: держать при температуре 4 ° c, pH 7,5 Имидазола 25 мм в Катодный буфер: Держите при температуре 4 °C, pH 7,5 Трицин 50 мм Имидазола 7,5 мм С или без Коомсси Блю (G250) 0,022% Таблица 5: буферы электрофорез. Составной Окончательная концентрация Комплекс I деятельности буфер: подготовить свежий в 5 мм рис-совместимого рН 7,4 Нинайтетазолиум синий 3 мм в Надн 14 мм в Комплекс II деятельности буфер: подготовить свежий в 5 мм рис-совместимого рН 7,4 Сукцинат 20 мм в ВБГ 0,2 мм Нинайтетазолиум синий 3 мм в Комплекс IV деятельности буфера: подготовить свежий в 50 mM Na-фосфат pH 7,2 Цитохром C 0,05 мм Диаминобензидин 2,3 мм Активность ATPsynthase буфер: подготовить свежий в воде, настроить рН до 8 с Кох Глицин 50 мм MgCl2 5 мм в HEPES 50 мм Качл2 30 мм в Atp 5 мм в Таблица 6: анализ активности в гелевых буферов. Составной Окончательная концентрация Трансфер буфер База «рис» 25 мм в Глицин 192 мм Sds 4 Метанола 20 ТБСТ База «рис» 20 мм в Nacl 137 мм Анимация 20 0,1% Таблица 7: иммуно-иммунные буферы. Комплекс Субъединицы Клон Я NDUFA9 20C11B11B11 Ii SDHA 2E3АТТЕСТАТА 12FB2AE2 Iii UQCRC2 13G12AF12BB11 Iv COX4 1D6E1A8 V АТПБ 3D5 Таблица 8: антитела, используемые для иммунооболтинга для обнаружения дыхательной цепи SC. Смотрите таблицу материалов для компаний и номера лота.

Discussion

В настоящее время активно изучаются Митохондриальные суперкомплексы для выяснения их физиологической роли и их значимости в патогенезе многочисленных заболеваний человека, будь то приобретенные или генетические Митохондриальные заболевания3,7 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14. для получения надежных результатов необходимо рассмотреть несколько аспектов. Этот протокол был протестирован с митохондриями печени митохондрий, мышь скелетных мышц митохондрий (результаты не показано), крысы сердца митохондрии, и человека фибровзрыва митохондрий (результаты не показали), но, безусловно, может быть адаптирована к другим источникам изолированных Митохондрии. Метод оптимально сочетает в себе различные аспекты протоколов BN и CN-страниц, позволяющих свести к минимуму воздействие моющих средств и анионных соединений по сравнению с опубликованными протоколами20,27,28.

Подготовка образцов

Подготовка образцов представляет собой решающий шаг для успешного разделения СКС. буферная композиция должна быть тщательно отобрана для того, чтобы добиться надлежащей растворизации белков и белков, при сохранении как можно большей их функциональной и структурной целостности. Ионная прочность и рН буфера извлечения являются двумя важными факторами для рассмотрения. Концентрация соли, которые являются слишком низкими (< 50 мм к-ацетат или накл) приведет к плохой растворенизации белков в присутствии неионных моющих средств, в то время как концентрация соли выше 500 mM будет способствовать укладки белка/агрегацию, и осадки ЦБ и белки29. Поэтому СКС следует экстрагируется с помощью буферов вблизи физиологических ионных сил. Что касается рН, рекомендуется использовать вблизи физиологических рН.

Тип моющего средства и соотношение моющего средства/белка также имеют решающее значение для оптимальной добычи SC. Для максимального сохранения родного СКС, оцифнин предпочтительнее26. Как показано в настоящем Протоколе и других опубликованных методах23,30,31,32, это мягкое моющее средство сохраняет супрамолекулярный состав нескольких SC собраний, и димерики и олигомерический состав Атфнтраза (рис. 3 и рис. 4). Титрование образцов, представляющих интерес с различным количеством дитонина, имеет решающее значение для определения условий, позволяющих оптимально растворимость, сохраняя активность фермента и физиологические взаимодействия белка. Titration должно быть выполнено с коэффициентами колебаясь между 2 и 8 g/g26. Оптимальные результаты для печени, скелетных мышц и сердечной митохондрий, соответственно, получаются с 4, 5 и 6 г белка. Следует отметить, что на замену дигонина может быть заменен Тритон X-100, который при оптимальных условиях приводит к аналогичной миграции и составу СК, как и к наблюдаемым с помощью дигонина2. Однако, это моющее средство следует использовать с осторожностью, так как относительно небольшое увеличение соотношения моющего средства/белка (например, от 1 до 1,5 г/г) может привести к полной диссоциации СБК сборки2, что может привести к экспериментальной несогласованности. После извлечения образцы традиционно дополняются коомсси Блю, чтобы дать белкам заряд при применении к гелю, за исключением традиционного CN-Page20,26. Чтобы свести к минимуму воздействие белка на Сомасси и потенциальную диссоциацию лабильных белков, образцы не дополняются синим цветом Комасси в этом протоколе.

Электрофорез

Оба CN-PAGE и BN-PAGE были использованы для изучения митохондриальных комплексов ОКФОС, каждый из них имеют явные преимущества и ограничения. Более мягкие условия, используемые при CN-PAGE (главным образом отсутствие ЦБ, который имеет моющее средство, как эффект), позволяет лучше сохранение АТФ синтаза в-гель деятельности, и ограничивает диссоциации лабильных белков в высокой молекулярной массы ГТС и АТФ-синтаза собраний26. Тем не менее, отсутствие анионного красителя CB в экстракт белка и электрофорез буферов вызывает белки мигрировать на основе их внутреннего заряда и Изоэлектрическая точка, которая уменьшает электрофоореотической мобильности белков в гель26. Кроме того, в отсутствие CB, белки с недостаточным отрицательным заряда, как правило, агрегировать, таким образом уменьшая разрешение белковых комплексов в гель20,26. Чтобы обойти эти ограничения, так называемая CN-PAGE с высоким разрешением была разработана Виттиг и Шрэггер20. В этом протоколе деоксичетные натрия (DOC) и различные мягкие неионные моющие средства (DDM, Тритон х 100) добавляются в Катодный буфер, чтобы сохранить мембранные белки и наложить отрицательный сдвиг заряда на белки, что приводит к значительному улучшению резолюции20.

Отличительной особенностью настоящего гибридного протокола CN/BN является то, что сопоставимая резолюция может быть достигнута без этих моющих средств. Мгновенное добавление ЦБ в Катодный буфер в начале электрофореза достаточно для ограничения агрегация белка и повышения подвижности в геле (рис. 3 и Рисунок 4). В результате эта гибридная методика обеспечивает превосходное разрешение различных сборок СС и очень низкую или не подверженность воздействию моющих средств. Наличие низкого количества CB также позволяет лучше сохранение деятельности CV, улучшение сохранения димерических и олигомерные сборки CV (рис. 3 и Виттиг и Шахтер 200526), и снижение синего фонового шума, который может препятствовать количественной оценке активности геля, особенно для ИСИ и ГТУ (рис. 2). Кроме того, отсутствие CB в экстракт белка ограничивает нарушения Лабильно белков взаимодействий в СКС. Например, физическое объединение АТФ-синтаза с ANT для формирования синтазы 33 или с циклофилином-D для регулирования открытия ptp 34 лучше рассматривать в отсутствие CB. Мгновенное воздействие ЦБ во время электрофореза только может поэтому быть полезным, чтобы выявить новые взаимодействия белка в СКС. в целом, этот гибридный протокол CN/BN-PAGE таким образом позволяет сочетать точные и быстрые измерения активности геля с аналитическими методы с участием 2D электрофорез, иммуно-обнаружения и/или протеомики для предварительного анализа СКС. Следует отметить, что с растущим интересом к СКС, все большее число исследований используют небольшие 10 х 10 см гели для родной PAGE. Хотя этот подход может быть достаточным для выявления грубых изменений в сборках SC изобилия, более низкая разделительная способность малых гелей, скорее всего, ограничивается решением тонких перемер или разрезают отдельные полосы для протеомического анализа. Более того, несколько исследований с использованием меньших гелей сообщили, что респирасома мигрирует в том же размере, что и Ацфнтсэ димер, что затрудняет их отмежеваться22. Таким образом, использование больших гелей должно быть благоприятствования.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Авторы хотели бы поблагодарить Дженну Росси за техническую помощь, и д-р Мирей Хачо, д-р Дэвид Паттен и д-р Ujval Анил Кумар для полезной дискуссии при разработке этого метода. Эта работа финансировалась канадскими институтами медицинских исследований (CIHR) и национальным научным и инженерным Советом Канады (NSERC). AC является получателем докторской премии-Фредерик Бантинг и Чарльз Лучшие стипендии Канады (CIHR).

Materials

3,3'-Diaminobenzidine tetra-hydrochloride hydrate Sigma D5637
6-amino caproic acid sigma A2504
Acrylamide Sigma A3553
Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate sigma A3377
Anti-ATPB antibody [3D5] – Mitochondrial Marker Abcam ab14730 Lot number GR3174539-12, RRID AB_301438
Anti-SDHA antibody [2E3GC12FB2AE2] Abcam ab14715 Lot number GR3235943-1, RRID AB_301433
Anti-UQCRC2 antibody [13G12AF12BB11] Abcam ab14745 Lot number GR304308-3, RRID AB_2213640
Bis N,N'-Methylene-Bis-Acrylamide Biorad 1610201
Brilliant Blue G Sigma 27815
COX4 Monoclonal Antibody (1D6E1A8) Invitrogen 459600 Lot number TI2637158, RRID AB_2532240
Cytochrome c from equine heart sigma C7752
Digitonin Sigma D141
Fisherbrand FH100M Multichannel Peristaltic Pumps Thermo Fisher 13-310-660
Imidazole Sigma I0250
Inner Glass Plates. Pkg of 2, 20 x 20 cm, glass plates for 20 cm PROTEAN II xi and PROTEAN II XL electrophoresis cells, use with outer plate Biorad 1651823
Model 485 Gradient Former. 40-175 ml acrylamide gradient former, includes valve stem and tubing kit, for use with Mini-PROTEAN multi-casting chamber systems Biorad 1654120
NDUFA9 Monoclonal Antibody (20C11B11B11) Invitrogen 459100 Lot number TD2536591, RRID AB_2532223
Nitrotetrazolium Blue chloride Sigma N6639
Outer Glass Plates. Pkg of 2, 22.3 x 20 cm, glass plates for 20 cm PROTEAN II xi and PROTEAN II XL electrophoresis cells, use with inner plate Biorad 1651824
Phenylmethanesulfonyl floride Sigma P7626
Powerpack 1000 Biorad Serial Number 286BR 07171
PROTEAN II Sandwich Clamps. Pkg of 2, clamps for running gels, for 20 cm PROTEAN II xi electrophoresis cell, 1 left and 1 right Biorad 1651902
PROTEAN II xi Cell. Large format vertical electrophoresis cell, 16 x 20 cm gel size, 4 gel capacity, spacers and combs Biorad 1651811
PROTEAN II xi Comb. Pkg of 1, 15-well, 1.5 mm, comb for PROTEAN II xi electrophoresis cell Biorad 1651873
PROTEAN II xi Multi-Gel Casting Chamber. Multi-gel casting chamber, 20 x 20 cm gel size, for up to ten 1.5 mm thick gels, includes sealing plate, gasket, separation sheets, acrylic blocks, PROTEAN II XL alignment cards Biorad 1652025
PROTEAN II xi Spacers. Pkg of 4, 1.5 mm, spacers for 20 cm PROTEAN II xi electrophoresis cell Biorad 1651849
SCIENCEWARE Utility Bags (10 x 12") 4 mil, Bel-Art, Box of 100 VWR 11215-388
Thick Blot Paper. Pkg of 25 sheets, 15 x 20 cm, absorbent filter paper, for use with Trans-Blot cassette Biorad 1703956
Trans-Blot Cell With Plate Electrodes and Super Cooling Coil. Transfer cell and cooling coil (#170-3912), includes 2 gel holder cassettes, buffer tank, lid with cables, fiber pads, 1 pack blot paper Biorad 1703939
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Shagger, H. Respiratory Chain Supercomplexes. IUBMB Life. 52 (3-5), 119-128 (2001).
  2. Acin-Perez, R., Fernandez-Silva, P., Peleato, M. L., Perez-Martos, A., Enriquez, J. A. Respiratory active mitochondrial supercomplexes. Molecular Cell. 32 (4), 529-539 (2008).
  3. Greggio, C., et al. Enhanced Respiratory Chain Supercomplex Formation in Response to Exercise in Human Skeletal Muscle. Cell Metabolism. 25 (2), 301-311 (2017).
  4. Schagger, H., Pfeiffer, K. The ratio of oxidative phosphorylation complexes I-V in bovine heart mitochondria and the composition of respiratory chain supercomplexes. Journal of Biological Chemistry. 276 (41), 37861-37867 (2001).
  5. Milenkovic, D., Blaza, J. N., Larsson, N. G., Hirst, J. The Enigma of the Respiratory Chain Supercomplex. Cell Metabolism. 25 (4), 765-776 (2017).
  6. Acin-Perez, R., Enriquez, J. A. The function of the respiratory supercomplexes: the plasticity model. Biochimica et Biophysica Acta. 1837 (4), 444-450 (2014).
  7. Vartak, R., Porras, C. A., Bai, Y. Respiratory supercomplexes: structure, function and assembly. Protein Cell. 4 (8), 582-590 (2013).
  8. Lapuente-Brun, E., et al. Supercomplex Assembly Determines Electron Flux in the Mitochondrial Electron Transport Chain. Science. 340 (6140), 1567-1570 (2013).
  9. Lazarou, M., Smith, S. M., Thorburn, D. R., Ryan, M. T., McKenzie, M. Assembly of nuclear DNA-encoded subunits into mitochondrial complex IV, and their preferential integration into supercomplex forms in patient mitochondria. The FEBS Journal. 276 (22), 6701-6713 (2009).
  10. Sun, D., Li, B., Qiu, R., Fang, H., Lyu, J. Cell Type-Specific Modulation of Respiratory Chain Supercomplex Organization. International Journal of Molecular Sciences. 17 (6), (2016).
  11. D’Aurelio, M., Gajewski, C. D., Lenaz, G., Manfredi, G. Respiratory chain supercomplexes set the threshold for respiration defects in human mtDNA mutant cybrids. Human Molecular Genetics. 15 (13), 2157-2169 (2006).
  12. Antoun, G., et al. Impaired mitochondrial oxidative phosphorylation and supercomplex assembly in rectus abdominis muscle of diabetic obese individuals. Diabetologia. 58 (12), 2861-2866 (2015).
  13. Kanaan, G. N., Patten, D. A., Redpath, C. J., Harper, M. -. E. Atrial Fibrillation Is Associated With Impaired Atrial Mitochondrial Energetics and Supercomplex Formation in Adults With Type 2 Diabetes. Canadian Journal of Diabetes. , (2018).
  14. Kuter, K., et al. Adaptation within mitochondrial oxidative phosphorylation supercomplexes and membrane viscosity during degeneration of dopaminergic neurons in an animal model of early Parkinson’s disease. Biochimica et Biophysica Acta. 1862 (4), 741-753 (2016).
  15. McKenzie, M., Lazarou, M., Thorburn, D. R., Ryan, M. T. Mitochondrial Respiratory Chain Supercomplexes Are Destabilized in Barth Syndrome Patients. Journal of Molecular Biology. 361 (3), 462-469 (2006).
  16. Rosca, M. G., et al. Cardiac mitochondria in heart failure: decrease in respirasomes and oxidative phosphorylation. Cardiovascular Research. 80 (1), 30-39 (2008).
  17. Jang, S., et al. Elucidating Mitochondrial Electron Transport Chain Supercomplexes in the Heart During Ischemia-Reperfusion. Antioxidants & Redox Signaling. 27 (1), 57-69 (2017).
  18. Frenzel, M., Rommelspacher, H., Sugawa, M. D., Dencher, N. A. Ageing alters the supramolecular architecture of OxPhos complexes in rat brain cortex. Experimental Gerontology. 45 (7), 563-572 (2010).
  19. Krause, F. Detection and analysis of protein-protein interactions in organellar and prokaryotic proteomes by native gel electrophoresis: (Membrane) protein complexes and supercomplexes. Electrophoresis. 27 (13), 2759-2781 (2006).
  20. Wittig, I., Karas, M., Schagger, H. High Resolution Clear Native Electrophoresis for In-gel Functional Assays and Fluorescence Studies of Membrane Protein Complexes. Molecular Cell Proteomics. 6, 1215-1225 (2007).
  21. Wittig, I., Braun, H. P., Schagger, H. Blue native PAGE. Nat Protoc. 1 (1), 418-428 (2006).
  22. Jang, S., Javadov, S. Current Challenges in Elucidating Respiratory Supercomplexes in Mitochondria: Methodological Obstacles. Frontiers in Physiology. 9, 238-238 (2018).
  23. Cuillerier, A., et al. Loss of hepatic LRPPRC alters mitochondrial bioenergetics, regulation of permeability transition and trans-membrane ROS diffusion. Human Molecular Genetics. 26 (16), 3186-3201 (2017).
  24. Pallotti, F., Lenaz, G. . Methods in Cell Biology. 80, 3-44 (2007).
  25. Wieckowski, M. R., Giorgi, C., Lebiedzinska, M., Duszynski, J., Pinton, P. Isolation of mitochondria-associated membranes and mitochondria from animal tissues and cells. Nature Protocols. 4, 1582 (2009).
  26. Wittig, I., Schägger, H. Advantages and limitations of clear-native PAGE. PROTEOMICS. 5 (17), 4338-4346 (2005).
  27. Jha, P., Wang, X., Auwerx, J. Analysis of Mitochondrial Respiratory Chain Supercomplexes Using Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis (BN-PAGE). Current Protocols in Mouse Biology. 6 (1), 1-14 (2016).
  28. Beutner, G., Porter, G. A. Analyzing Supercomplexes of the Mitochondrial Electron Transport Chain with Native Electrophoresis, In-gel Assays, and Electroelution. Journal of Visualized Experiments. (124), e55738 (2017).
  29. Von Hagen, J. . Proteomics Sample Preperation. , 485 (2008).
  30. Couoh-Cardel, S. J., Uribe-Carvajal, S., Wilkens, S., García-Trejo, J. J. Structure of dimeric F1F0-ATP synthase. The Journal of Biological Chemistry. 285 (47), 36447-36455 (2010).
  31. Strauss, M., Hofhaus, G., Schröder, R. R., Kühlbrandt, W. Dimer ribbons of ATP synthase shape the inner mitochondrial membrane. The EMBO Journal. 27 (7), 1154-1160 (2008).
  32. Schägger, H., Pfeiffer, K. Supercomplexes in the respiratory chains of yeast and mammalian mitochondria. The EMBO Journal. 19 (8), 1777-1783 (2000).
  33. Wittig, I., Schägger, H. Structural organization of mitochondrial ATP synthase. Biochimica et Biophysica Acta – Bioenergetics. 1777 (7), 592-598 (2008).
  34. Giorgio, V., et al. Dimers of mitochondrial ATP synthase form the permeability transition pore. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United Stated of America. 110 (15), 5887 (2013).

Tags

Mitochondrial Respiratory Chain SupercomplexesBlue Native PAGEClear Native PAGEHybrid Clear/blue Native ElectrophoresisMitochondrial IsolationDigitonin ExtractionGradient Gel Electrophoresis

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Cuillerier, A., Burelle, Y. Hybrid Clear/Blue Native Electrophoresis for the Separation and Analysis of Mitochondrial Respiratory Chain Supercomplexes. J. Vis. Exp. (147), e59294, doi:10.3791/59294 (2019).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image