수지상 필로포디아 풍부한 분획의 정화
Summary
이 프로토콜에서는 수지상 필로포디알 사이의 특이적이고 강한 친화력을 활용하여 배양된 해마 뉴런상의 식수컵형 돌출 구조로부터 수지상 필로포디아가 풍부한 분획을 정화하는 방법을 소개합니다. 접착 분자, TLCN, 및 세포외 매트릭스 분자, vitronectin.
Abstract
수지상 필로포디아는 액틴 필라멘트에 기초하여 얇고 긴 돌출부이며, 표적 축색을 찾는 것처럼 확장하고 후퇴합니다. 수지상 필로포디아가 표적 축색과 접촉하면 척추로 성숙하기 시작하여 시냅스의 형성으로 이어집니다. 텔렌세팔린 (TLCN)은 수지상 필로포디아에 풍부하게 국한되어 있으며 점차 척추에서 제외됩니다. 배양된 해마 뉴런에서 TLCN의 과발현은 수지상 우포ODIa 형성을 유도한다. 우리는 텔렌스팔린이 세포외 매트릭스 분자인 비트로네틴에 강하게 결합한다는 것을 보여주었습니다. Vitronectin 코팅된 마이크로비드는 신경 모수석에 식세포 컵 형성을 유도했습니다. 식세포 컵, TLCN, 인산화 된 에즈린 / 라디신 / 모에신 (포스포 – ERM) 및 F-액틴과 같은 TLCN 결합 단백질이 축적되어 식세포 컵의 성분이 수지상 필로포디아와 유사하다는 것을 시사합니다. 따라서 수지상 필로포디아 대신 식세포 컵을 정화하는 방법을 개발했습니다. 마그네틱 폴리스티렌 구슬은 비트론틴으로 코팅되었고, 이는 해마 뉴런의 배양 배지에 풍부하게 존재하며 뉴런 모수석에 식세포 컵 형성을 유도합니다. 24시간 배양 후, 식세포 컵을 세제로 경미하게 용해시키고 자석 분리기를 사용하여 수집했습니다. 구슬을 세척한 후, 결합 단백질을 용출하고 은 염색 및 웨스턴 블로팅에 의해 분석시켰다. 결합 분획에서, TLCN 및 액틴은 풍부하게 존재했다. 또한, 분획으로부터 확인된 많은 단백질은 수지상 필로포디아로 국소화되었다; 따라서, 우리는 수지상 filopodia 풍부한 분획으로 결합 분획을 명명했다. 이 기사에서는 수지상 필로포디아 가풍부한 분획에 대한 정제 방법에 관한 세부 사항을 설명합니다.
Introduction
수지상 필로포디아는 척추의 전구체로 생각됩니다. 수지상 필로포디아의 액틴 필라멘트는 확장 및철회를조절1,2,3. 축축액과 접촉 한 후 선택된 수지상 필로포디아가 척추로 성숙을 시작하고 시냅스가4,5로형성됩니다. 척추의 성분은 후진성 밀도 분획6,7의포괄적 인 분석에서 결정되었으며 수지상 필로포디아의 구성 요소는 크게 알려지지 않았습니다. 텔렌스팔린(TLCN), ERM, SynGAP, Ras, PI3 키나아제, Akt, mTOR, 폴로유사 키나아제 2, CaMKII, 신데칸-2, 파라레민-1, ARF6 및 EphB가 수지상 필로포디아 형성 5,8,9를 조절하는 것으로 나타났습니다. ,10,도 11,수지상 필로포디아에 존재하는 분자의 포괄적인 분석을 위한 방법이 개발되지 않은 반면.
TLCN(ICAM-5)은 특히 가장 로스트랄 뇌 세그먼트에서 가시 뉴런에 의해발현되며, 텔렌세판론(12). TLCN은 세포외 영역, 막막 영역 및 세포질 꼬리13에9 개의 Ig 유사 도메인을 가지고 있습니다. TLCN은 세포외 영역에서 비트로넥틴(VN) 및 LFA-1 인테그린에 결합하고, 세포막 영역에서 프레세닐린을, 세포질 영역에서 인광-ERM 및 α-액티닌에 결합합니다 5,8,14,15 ,16. TLCN은 수지상 필로포디아 및 α-액티닌의 끝에서 인광-ERM을 통해 세포골격에 결합하고 척추 및 수지상샤프트 8,16.
우리는 TLCN의 과발현이 수지상 필로포디아 형성을 강화하고 가시가 필로포디아(10)로 복귀하도록 유도하는 것을 보여주었다. TLCN 세포질 영역에 결합된 에즈린의 구성활성 형태및 강화된 수지상 필로포디아형성 8. 따라서 TLCN은 액틴 결합 단백질을 통해 수지상 필로포디아 형성을 조절합니다. Esselens 외. 마이크로비드가 배양된 뉴런에 TLCN 축적을 유도한다는 것을 입증했다17. 우리는 식세포 컵 구조가 TLCN 의존적인 방식으로 VN 코팅 된 마이크로 비드 주위의 신경 모수석에 형성되었다는 것을 보여주었다15. 수지상 필로포디아의 성분은 식세포 컵과 유사합니다. 수지상 필로포디아를 수집하는 것은 어렵지만 자기 마이크로 비드를 사용하여 식세포 컵을 수집하는 것이 상대적으로 쉽습니다. 따라서 수지상 필로포디아(18) 대신 식수구컵을 정화하는 방법을개발하였다. 여기서, 수지상 필로포디아 풍부 분획에 대한 정제 방법을 설명한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
우리는 세포 부착 분자 TLCN과 세포 외 매트릭스 단백질 비트로넥틴 사이의 친화성을 사용하여 수지상 필로포디아가 풍부한 분획에 대한 정제 방법을 개발했습니다. PSD 분획에 비해, 수지상 필로포디아 가 풍부한 분획으로부터 미성숙 시냅스상에 작용하는 시냅스 단백질을 식별할 수 있었다. 따라서, 수지상 필로포디아-풍부한 분획의 성분은 74%에 의해 PSD 분획의 성분과 상이하다. PSD 분획과는 달?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
해마 뉴런의 저밀도 배양, TLCN 결핍 마우스를 위한 미시나 마사요시, 기술 지원을 위한 미쓰이 사치코, 시오자키 모모코, 요시하라 연구소 회원에게 도움이 되는 토론에 대해 감사합니다. . 이 작품은 JSPS 카켄히 그랜트 노스에 의해 지원되었다. JP20700307, JP22700354, JP24500392 및 MEXT 카켄히 그랜트 노스. JP23123525 ~ YF 및 JP20022046, JP18H04683 및 JP18H05146 ~ YY.
Materials
| 1 M HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| 1.7 ml Low Binding MCT | Sorenson BioScience | 39640T | |
| 200 mM L-Glutamine | Gibco | 2530149 | |
| 35-mm plastic cell culture dishes | Corning | 430165 | |
| Anti-actin | Sigma-Aldrich | A-5060 | |
| Anti-alpha-Actinin | Sigma-Aldrich | A-5044 | |
| Anti-alpha-tubulin | Sigma-Aldrich | T-9026 | |
| Anti-Ezrin | Sigma-Aldrich | clone3C12, SAB4200806 | |
| Anti-Galphaq | Santacruz | sc-393 | |
| Anti-MAP2 | Chemicon | clone AP20, MAB3418 | |
| Anti-Moesin | Sigma-Aldrich | clone 38/87, M7060 | |
| Anti-PLCbeta1 | Santacuz | sc-5291 | |
| Anti-PSD95 | MA2 | ABR | |
| Anti-Spectrin beta | Chemicon | MAB1622 | |
| B27 | Gibco | 0080085SA | |
| BCA protein assay kit | Thermo | 23227 | |
| Bromophenol blue | Merck | 1.08122.0005 | |
| calcium chrolide, hydrous | Wako | 038-19735 | |
| Cell scraper | Falcon | 353085 | |
| Cell strainer | Falcon | 352350 | |
| Choline chloride | Sigma-Aldrich | C7527 | |
| Complete EDTA free protease inhibitor cocktail | Roche | 11873580001 | |
| Cytosine beta-D-arabinofuranoside | Sigma-Aldrich | C-6645 | |
| DNase-I | Sigma-Aldrich | DN-25 | |
| D-Pantothenic acid hemicalcium salt | Sigma-Aldrich | P5155 | |
| DynaMag-2 Magnet | Thermo | 12321D | |
| ECL Prime Western Blotting Detection Reagent | GE | RPN2232 | |
| e-PAGEL 5-20% SDS-PAGE gradient gel | ATTO | E-T520L | |
| Folic acid | Sigma-Aldrich | F8758 | |
| HBSS | Gibco | 14175095 | |
| HRP-conjugated anti-rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | 111-035-144 | |
| i-Inositol | Sigma-Aldrich | I7508 | |
| LAS-1000 mini | Fuji Film | LAS-1000 mini | For detection of luminescence from WB membrane |
| Magnetic polystyrene microbeads | Sperotech | PM-20-10 | |
| MEM amino acid solution | Gibco | 11130-051 | 30 mM L-Arginine hydrochloride, 5 mM L-Cystine, 10 mM L-Histidine hydrochloride-H2O, 20 mM L-Isoleucine, 20 mM L-Leucine, 19.8 mM L-Lysine hydrochloride, 5.1 mM L-Methionine, 10 mM L-Phenylalanine, 20 mM L-Threonine, 2.5 mM L-Tryptophan, 10 mM L-Tyrosine, and 20 mM L-Valine |
| Mini-slab size electrophoresis system | ATTO | AE-6530 | |
| Niacinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | |
| Penicilin / Streptomycin | Gibco | 15070063 | |
| PhosSTOP phosphatase inhibitor cocktail | Roche | 4906845001 | |
| Poly-L-lysine hydrobromide | Nacali | 28360-14 | |
| Pyridoxal HCl | Sigma-Aldrich | P6155 | |
| Riboflavin | Sigma-Aldrich | R9504 | |
| Silver Stain 2 Kit wako | Wako | 291-5031 | |
| Thiamine HCl | Sigma-Aldrich | T1270 | |
| Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell | Bio-rad | 1703940JA | |
| Ultra pure water | MilliQ | For production of ultra pure water |
References
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