该协议概述了生成模型系统所需的步骤, 在该模型系统中, 相关内源基因的转录可以在活体动物或细胞中使用增强的 lac 抑制和/或 tet激活剂系统有条件地控制。
在这里, 我们描述了一个协议, 实现 remote 控制系统 (re可理解 m anipulation of t 输药在endogenous loci), 它允许可逆和可调谐的表达式控制生命模型系统中感兴趣的内源基因。remte 控制系统采用强化的乳酸抑制和泰特激活系统, 以实现在单一生物系统中对目标基因的向下或上行。通过抑制转录伸长率, 可以通过灵活地位于转录起始位点下游的抑制位点来实现严格的抑制。通过靶向同源启动子的转录激活剂, 增强内源基因的转录, 可以获得鲁棒的增强。这种可逆和可调谐的表达控制可以应用和反复撤回的生物体。该系统的有效性和多功能性, 如这里为内源性 Dnmt1所示, 将允许更精确的体内功能分析, 通过允许在不同的表达水平上的基因功能的调查, 并通过测试的可逆性表。
遗传敲除或转基因方法已成为研究动物模型基因功能的有效手段。然而, 这些方法的表达调控是二分法的, 非时间性的, 因此不能揭示基因的完整功能谱。条件 Cre /oxp技术允许时空失活或激活基因功能 , 但其二分法性质继续构成局限性 , 如细胞杀伤力和不可逆性1,2,3. 为了填补这一空白, 使用 tet 调控的 Shrna 或mirna4开发了有条件的敲除方法。然而, 非目标效应仍然是 RNAi5关注的问题, 在体内控制一直具有挑战性.最近, crisprc 介导的转录控制技术引入了一种更加通用的方法来实现内源基因表达的上升和下降调控, 并展示了它们的效用6,7.然而, crisprc 介导的转录控制的有效性在体内尚不清楚, 基于 krab 的抑制的可逆性还有待观察, 因为 KRAB 的强力抑制及其相互作用的蛋白质 KAP1 已被证明会诱发永久基因沉默8,9。
为了解决这些局限性, 我们开发了一种新的转录调控系统, 能够利用工程原核二元转录以可逆和可调谐的方式有条件地控制小鼠内源性基因表达监管制度10。原核二元转录调节系统与调节配体, 如lac和tet, 已经启用了这样的可逆和可调谐的表达控制11,12,13, 14. 然而, 目前的二元系统抑制能力不足, 妨碍了它们被广泛采用, 以控制哺乳动物的内源性基因表达。我们开发了一种增强的 lac 抑制系统, 该系统足以抑制内源基因, 并采用了一种新的策略, 将转录激活剂直接靶向到内源基因的同源启动子, 以实现鲁棒放大 (图 1)10。利用这项技术, 我们在可调谐、诱导和可逆的方式10中实现了内源性 dnmt1基因近两个数量级的表达控制。在这里, 我们提供了一步一步的指导, 它在体内应用于其他基因和生物使用小鼠作为模型物种。
图 1: 远程控制系统概述.内源性靶基因的转录可以通过工程lac抑制和tet激活剂系统进行调控。目标基因启动子或内含子被设计为包含紧密结合的 LacIGY 抑制剂和/或 rtta-m2 激活剂的运算符。R 表示 Repron (Repron (rep-回归 intr on), 其中包含12个对称 lac 运算符 (s) 加上部分兔子β-球蛋白内含物。T 表示tet运算符。抑制剂和催化剂是由组织特异性启动子表达的。然后, 通过给药 IPTG (作为 lacigny 抑制剂的拮抗剂) 或多西环素 (dox) 的 IPTG (异丙基β-d-1-硫代角糖苷) 或多西环素 (Dox), 可以将目标基因的表达可逆地调整到所需的表达水平。这个数字已经从 Lee 等人的修改.请点击这里查看这个数字的更大版本.
在开始此协议之前, 请查看表 1 , 以确定所需的基因表达控制的相关步骤。例如, 要设计一个鼠标, 使 “基因 X” 的可逆下调, 完成以下协议的第1、3和4节。表 1还总结了 remote 控制系统所需的组件。
所需的表达式更改 | 仅限镇压 | 仅激活 | 抑制和激活 |
《议定书》的相关章节 | 1, 3-4 | 2-4 | 1-4 |
目标基因中所需的运动控制序列 | Repron (“抑制内含子”; 12个对称 lac 运算符加上部分兔子β-球蛋白内含子) | 泰特运算符 | Repron 和 Tet 运算符 |
控制序列位置 | 内含 子 | 促进 | Intron & 启动子 |
所需的控制所需的激活不压机 | LacIGY 抑制器 | Rtta-m2 激活剂 | LacIGY 抑制剂和 Rtta-m2 激活剂 |
监管配体 | IPTG | 多西环素 | IPTG 和/或多西环素 |
表 1:控制组件概述.
remote 控制系统的一个关键步骤和潜在限制是在不影响目标基因表达的情况下插入抑制剂和/或激活剂结合位点所带来的挑战。我们最初的抑制方法, 适用于dnmt1基因, 包括在转录关键区域内插入乳酸抑制结合位点的启动子。为了降低影响启动子功能的风险, 从而提高 remote 控制系统的普遍适用性, 我们开发了一种基于内部的抑制方法。我们增强的 lac系统的效力使我们能够严格地抑制所有强启动子的转录, 我们在转录起始位下游数百到几千基酶的运算符中测试过这些启动子 (图3a-c)10. 重要的是, 抑制的程度与促进者的转录强度无关 (图 3a–c)10。这表明, 我们基于内部的压制系统的压制能力超过了被测试的促进者的转录强度。在这种基于内的方法中, 抑制很可能是通过转录伸长机制和 lac 抑制剂57这两个成分之间的物理干扰来介导的。这种简单的抑制机制和基于内的方法所证明的稳健性可能会使这种方法普遍适用于不同的基因、组织和生物体。
remote 控制系统的控制要求转位剂结合序列接近目标基因启动子, 这就带来了影响启动子功能的风险。然而, 我们发现绑定序列的位置可以在转录临界区域之外。从位于转录起始点上游的几百个碱基中,对 Dnmt1和ef1 α启动子进行了有力的放大.这种松弛约束极大地降低了在没有转化剂的情况下影响目标基因启动子功能的机会。增加结合序列的数量和/或使用更强的转化剂可以帮助进一步降低风险, 使更远的地点更远离转录起始位点的位置上进行增强。
我们的 remote 控制系统提供了对内源基因表达的水平、时间和位置的优雅控制, 允许测试表型的可逆性和不同表达水平的后果, 而这是不容易实现的目前体内基因表达控制技术。需要注意的是, 在包括我们在内的大多数基因表达分析中, 表达值代表了细胞群体的平均值, 其中可以发现相当大的差异。这种异质性可能会影响细胞决策过程, 如分化或凋亡58。尽管额外的基因工程 59可能会进一步提高基因表达控制的精度, 但我们目前系统的观测到的效力将使我们能够在许多生物环境中对基因功能进行有益的研究。此外, 由于操作序列的复杂性以及哺乳动物与监管成分的原始物种之间的进化距离很大, 预计目标特异性会很高。此外, 转基因小鼠系的抑制剂和激活剂可以开发和应用于任何内源基因。例如, 现有的 tet转位动物模型可以被调整为在所需的小鼠组织中完成目标基因的增加。我们最近开发了一条转基因线, 通过将lacgy基因引入 Hipp11 位点 48, 可以在多个组织类型中驱动增强 lac 抑制剂的增强型组织特异性表达 在 Loxs-stop-lox 元素的控制下 (未发布)。这条线路将大大便利 remte 控制系统的组织特异性应用。
与目前诱导的转基因方法相比, remte 控制系统的基因控制提供了几个优点。它不需要生成多个转基因线来测试插入的位置效果, 因为它利用内源性位点。此外, 这种方法非常适合具有强基线表达的基因的提升, 因为它增强了已经强大的启动子的表达, 而传统的转基因模型依赖于最小的病毒启动子。最后, 我们的方法可以保留目标基因的组织特异性、细胞周期控制和剪接变体, 因为它保留了自然调节的元素, 如先天的 cis-调控元素。crispr· cicpr 介导的基因靶向技术的出现将极大地促进这一技术在各种模型系统中的应用。
The authors have nothing to disclose.
我们感谢已故的海蒂·斯库夫医生慷慨赠送了哺乳动物 lacI 基因结构 (明尼苏达州罗切斯特梅奥诊所), 丹尼尔·卢沃德医生 (法国巴黎居里研究所) 提供了维林推广人员, 劳里·杰克逊-格鲁斯比医生 (儿童医院,波士顿, 马萨诸塞州) 为她的贡献, 这项技术开发的早期阶段。我们感谢吴南茜博士和罗伯特·马克森博士在产生转基因和淘汰赛小鼠方面提供的帮助。我们感谢莱尔德实验室成员的有益讨论和支持。这项工作得到了国家卫生研究院 [R01 CA75090、R01 DA030325、R01 CA157918 和 R01 CA212374 至 p. w. l. 和1F31CA21397-01A1 至 n. a. v. s] 的支持。
B6C3F1/J | The Jackson Laboratory | 100010 | https://www.jax.org/strain/100010 |
Cas9 Protein | PNA Bio | CP04 | http://www.pnabio.com/products/CRISPR_Cas9.htm?gclid=EAIaIQobChMIsoG8pLL33QIVBr7ACh0naQ4dEAAYAiAAEgKyHvD_BwE |
CRISPOR | Haeussler et al. 2016 | http://crispor.tefor.net/ | |
Doxycycline-Containing Mouse Diet | Envigo | Varies by concentration | https://www.envigo.com/products-services/teklad/laboratory-animal-diets/custom-research/doxycycline-diets/ |
ENCODE Database | Stanford University | https://www.encodeproject.org/ | |
iCre mRNA synthesis plasmid (pBBI) | Addgene | 65795 | https://www.addgene.org/65795/ |
IPTG | GoldBio | I2481C | https://www.goldbio.com/search?isSearch=Y&q=iptg |
pGL3-Basic | Promega | E1751 | https://www.promega.com/products/reporter-assays-and-transfection/reporter-vectors-and-cell-lines/pgl3-luciferase-reporter-vectors/?catNum=E1751 |
SVM-BPfinder | Regulatory Genomics, Pompeu Fabra University | http://regulatorygenomics.upf.edu/Software/SVM_BP/ | |
TiProD: Tissue specific promoter Database | Department of Bioinformatics, UMG, University of Göttingen | http://tiprod.bioinf.med.uni-goettingen.de | |
UCSC Genome Browser | University of California Santa Cruz | https://genome.ucsc.edu/ |