Detta protokoll beskriver de steg som behövs för att generera modellsystem där transkriptionen av en endogen gen av intresse kan styras villkorligt i levande djur eller celler använder förbättrad lac repressor eller tet aktivare system.
Här beskriver vi ett protokoll för genomförandet av systemet med fjärrkontroll (Reversible Manipulation of Transcription på Endogenous loci), vilket möjliggör reversibla och avstämbara uttryck kontroll av en endogena gen av intresse på levande modell system. Fjärrkontroll systemet använder system för förbättrad lac -förtryck och tet aktivering att uppnå ned- eller uppreglering av en målgenen inom ett enda biologiska system. Tight förtryck kan uppnås från repressor bindningsställen flexibelt ligger långt nedströms en transkription startwebbplats genom att hämma transkription töjning. Robust uppreglering kan uppnås genom att förbättra transkriptionen av en endogen gen genom att rikta tet transkriptionell aktivatorer till cognate arrangören. Reversibel och avstämbara uttryck kontrollen kan tillämpas och dragit tillbaka upprepade gånger i organismer. Styrkan och mångsidighet av systemet, som visats för endogena Dnmt1 här, kommer att möjliggöra mer exakt Invivo funktionella analyser genom att aktivera utredning av geners funktion på olika nivåer och genom att testa reversibiliteten av en fenotyp.
Genetiska knockout eller transgena metoder har varit effektiva medel för att studera geners funktion i djurmodeller. Dock uttryck förordning av dessa synsätt är dikotoma (på/av), icke-temporal, och således är inte kapabel att avslöja kompletta funktionella spectrumen av en gen. Villkorliga Cre/LoxP technologies har tillåtit plats och tid inaktivering eller aktivering av geners funktion, men deras dikotomiska naturen fortsätter att utgöra begränsningar, till exempel cell dödlighet och oåterkallelig1,2 , 3. för att fylla detta tomrum, villkorlig knockdown metoder har utvecklats med hjälp av tet-reglerade shRNA eller miRNA4. Men off-target effekter förbli en angelägenhet för RNAi5 och har varit en utmaning för att styra i vivo. Mer nyligen, CRISPR/Cas-medierad transkriptionell-control teknik har infört en mer mångsidig strategi för att uppnå både upp- och nedreglering av endogena genuttryck och visat deras verktyg6,7 . Dock effektiviteten i CRISPR/Cas-medierad transkriptionell kontroll är ännu oklart i vivo, och reversibiliteten av KRAB-baserade repression återstår att ses, så starkt förtryck av KRAB och dess interagerande protein KAP1 har visats inducera permanent nedtystning8,9.
För att hantera dessa begränsningar, har vi utvecklat en roman transkriptionell regelsystemet kan villkorligt styra endogena genuttryck i en reversibel och avstämbara sätt i möss med konstruerad prokaryota binära transkriptionell regelsystem10. Prokaryota binära transkriptionell regelsystem med föreskrivande ligander, såsom lac och tet, har aktiverat sådana vändbar och avstämbara uttryck styra11,12,13, 14. dock otillräcklig förtryck styrkan hos de nuvarande binära systemen har hindrat deras bred antagande för styrning av endogena genuttryck hos däggdjur. Vi utvecklat en förbättrad lac förtryck system tillräckligt potenta för undertryckandet av endogena gener och anställd en roman strategi av inriktning tet transkriptionell aktivatorer direkt till cognate arrangören av en endogen gen att uppnå robust uppreglering (figur 1)10. Med denna teknik, har vi uppnått nästan två tiopotenser uttryck kontroll av endogena Dnmt1 genen i en avstämbara, inducerbara och reversibel sätt10. Här tillhandahåller vi stegvisa instruktioner för dess Invivo tillämpning på andra gener och organismer med möss som modell art.
Figur 1 : Översikt över systemets fjärrkontroll. Transkriptionen av en endogen målgenen kan regleras med hjälp av bakåtkompilerade lac repressor och tet aktivare system. Den mål genen arrangören eller intron är konstruerad för att innehålla operatörer för den snäva-bindande LacIGY repressor eller rtTA-M2 aktivator. R visar Repron (Repression intrpå), som innehåller 12 symmetriska lac operatorer (S) plus en partiell kanin beta-globin intron. T anger tet operatör. Den repressor eller aktivator/uttrycks från en vävnad-specifika Promotorn. Uttrycket av målgenen kan sedan reversibelt stämmas till önskat uttryck nivå genom administrering av IPTG (isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside, en antagonist till den LacIGY repressor) eller doxycyklin (Dox). Denna siffra har ändrats från Lee et al.10vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Innan du börjar detta protokoll, se tabell 1 för att identifiera de relevanta stegen för önskad kontroll av genuttryck. Exempelvis för att iscensätta en mus som gör reversibel nedreglering av ”Gen X”, fylla i avsnitten 1, 3 och 4 i den nedan protokoll. Tabell 1 sammanfattar också de nödvändiga komponenterna i systemets fjärrkontroll.
Önskat uttryck förändring | Förtrycket bara | Enbart aktivering | Både förtryck och aktivering |
Relevanta delar av protokollet | 1, 3-4 | 2-4 | 1-4 |
Fjärrkontroll sekvens behövs i målgenen | Repron (”förtryck intron”; 12 symmetriska lac operatörer plus en partiell kanin beta-globin intron) | Tet aktörerna | Repron och Tet aktörerna |
Fjärrkontroll sekvens läge | Intron | Arrangören | Intron & arrangören |
Aktivator/Repressor behövs för önskad kontroll | LacIGY Repressor | rtTA-M2 aktivator | LacIGY Repressor och rtTA-M2 aktivator |
Reglerande ligander | IPTG | Doxycyklin | IPTG och/eller doxycyklin |
Tabell 1: Översikt över fjärrkontrollen komponenter.
Ett kritiskt steg och potentiell begränsning av fjärrkontroll systemet är den utmaning som är associerad med insättningspunkten repressor eller aktivator bindande platser utan att påverka mål genuttryck. Vår ursprungliga förtryck strategi, involverade som tillämpas för genen Dnmt1 , införande av lac repressor bindande platser inom transcriptionally kritiska regioner i en promotor. För att minska risken som påverkar arrangören funktion och därigenom förbättra den allmänna tillämpligheten av fjärrkontroll systemet, vi utvecklat betraktelsesätt intron-baserade förtryck. Styrkan av vår förbättrade lac systemet tillät oss att tätt förtränga transkriptionen av alla starka tillskyndarna vi testat på operatörer som ligger hundratals till flera kilobases nedströms av transkriptionen starta platser (figur 3A – C) 10. allt förtryck var oberoende av transkriptionell styrkorna av de projektansvariga (figur 3A – C)10. Detta tyder på att förtryck kapaciteten hos våra intron-baserade förtryck systemet överskrider testade initiativtagarna transkriptionell styrka. I detta intron-baserat tillvägagångssätt är det sannolikt att förtrycket medieras genom fysiska störningar mellan två komponenter, transkription töjning maskinen och den lac kvinnoförtryckarna57. Denna enkla förtryck mekanism och påvisade robustheten av intron-baserade metoden kan göra detta tillvägagångssätt allmänt tillämpliga på olika gener, vävnader och organismer.
Uppreglering av fjärrkontroll systemet kräver transactivator bindande sekvenser att vara i närheten av promotorn mål genen, som medför risk för påverkar arrangören funktion. Vi fann dock att placeringen av bindande sekvenser kan vara utanför regionen transcriptionally kritiska. Både Dnmt1 och EF1α initiativtagare var kraftigt uppreglerad från tet aktörer ligger ett par hundra baser uppströms av transkription start platser10. Här avslappnad villkoret minskar chansen påverka arrangören funktion av en målgenen i avsaknad av transactivator. Öka antalet bindande sekvenser och/eller användningen av starkare transactivators kunde hjälpa till att ytterligare minska risken genom att aktivera uppreglering från platser längre bort från webbplatsen transkription start.
Vår fjärrkontroll systemet ger eleganta kontroll av nivå, tidpunkten och platsen för endogena genuttryck, möjliggör testning reversibiliteten av en fenotyp och följderna av olika uttryck nivåer, som inte lätt kan uppnås genom aktuella i vivo gen uttryck-control teknik. Det är viktigt att notera att i de flesta gen uttryck analyser, inklusive vår, uttryckets värden representerar i genomsnitt en population av celler bland vilka betydande variation kan hittas. Denna heterogenitet kan påverka cellulära beslutsprocesser, såsom differentiering eller apoptos58. Även om precisionen i gen uttryck kontroll kunde sannolikt ytterligare förbättras genom ytterligare genetiska krets engineering59, gör observerade styrkan av vårt nuvarande system att användbar undersökning av geners funktion i många biologiska sammanhang. Dessutom förväntas en hög grad av målet specificitet på grund av komplexiteten av operatören sekvenser samt stora evolutionära avståndet mellan däggdjur och de ursprungliga arterna av reglerande komponenter60. Transgena möss rader kvinnoförtryckarna och aktivatorer kan dessutom utvecklas och anställd för någon endogena gen. Till exempel kan befintliga tet transactivator musmodeller anpassas för att åstadkomma uppreglering av en målgenen i önskad mus vävnader. Vi har nyligen utvecklat en transgena linje som kan köra robust vävnad-specifika uttryck för vår förbättrade lac repressor i flera vävnadstyper när de kombineras med befintliga Cre linjer genom att införa den lacIGY genen i det Hipp11 locus48 under kontroll av ett Lox-STOP-Lox element (opublicerade). Denna linje skulle väsentligt underlätta vävnadsspecifika tillämpningen av systemets fjärrkontroll.
Gen uppreglering av fjärrkontroll systemet ger flera fördelar jämfört med nuvarande inducerbara transgena metoder. Det kräver inte generation av flera transgena linjerna att testa för position effekter av införande, eftersom det använder det endogena locus. Dessutom, är detta tillvägagångssätt väl lämpad för uppreglering av gener med stark baslinjen uttryck eftersom det förbättrar uttryck från en redan robusta Promotorn, medan konventionella transgena modeller förlitar sig på minimal viral initiativtagare. Slutligen, vävnaden specificitet, cellcykeln kontroll och skarvning varianter av en målgenen får behållas vid uppreglering av vår strategi, eftersom det bevarar element av naturliga förordning såsom medfödda cis-reglerande element. Tillkomsten av CRISPR/Cas-medierad gen-inriktning teknik kommer kraftigt att underlätta tillämpningen av denna teknik i olika modellsystem.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar den sena Dr Heidi Scrable för hennes generösa gåva på den däggdjur lacI gen konstruktion (Mayo Clinic, Rochester, MN), Dr Daniel Louvard (Institut Curie, Paris, Frankrike) för att tillhandahålla Promotorn Villin och Dr Laurie Jackson-Grusby (Children’s Hospital, Boston, MA) för hennes bidrag till de tidiga stadierna av denna teknikutveckling. Vi är tacksamma för Dr Nancy Wu och Dr Robert Maxson för deras hjälp generera de transgena och knockout-möss. Vi tacka medlemmarna i Laird laboratoriet för bra diskussioner och stöd. Detta arbete stöds av National Institutes of Health [R01 CA75090, R01 DA030325, R01 CA157918 och R01 CA212374 till P.W.L. och 1F31CA213897-01A1 till N.A.V.S].
B6C3F1/J | The Jackson Laboratory | 100010 | https://www.jax.org/strain/100010 |
Cas9 Protein | PNA Bio | CP04 | http://www.pnabio.com/products/CRISPR_Cas9.htm?gclid=EAIaIQobChMIsoG8pLL33QIVBr7ACh0naQ4dEAAYAiAAEgKyHvD_BwE |
CRISPOR | Haeussler et al. 2016 | http://crispor.tefor.net/ | |
Doxycycline-Containing Mouse Diet | Envigo | Varies by concentration | https://www.envigo.com/products-services/teklad/laboratory-animal-diets/custom-research/doxycycline-diets/ |
ENCODE Database | Stanford University | https://www.encodeproject.org/ | |
iCre mRNA synthesis plasmid (pBBI) | Addgene | 65795 | https://www.addgene.org/65795/ |
IPTG | GoldBio | I2481C | https://www.goldbio.com/search?isSearch=Y&q=iptg |
pGL3-Basic | Promega | E1751 | https://www.promega.com/products/reporter-assays-and-transfection/reporter-vectors-and-cell-lines/pgl3-luciferase-reporter-vectors/?catNum=E1751 |
SVM-BPfinder | Regulatory Genomics, Pompeu Fabra University | http://regulatorygenomics.upf.edu/Software/SVM_BP/ | |
TiProD: Tissue specific promoter Database | Department of Bioinformatics, UMG, University of Göttingen | http://tiprod.bioinf.med.uni-goettingen.de | |
UCSC Genome Browser | University of California Santa Cruz | https://genome.ucsc.edu/ |