Questo protocollo illustra i passaggi necessari per generare un sistema di modello in cui la trascrizione di un gene endogeno di interesse può essere controllata in modo condizionale in animali vivi o celle utilizzando avanzata lac repressore e/o sistemi di attivatore di tet .
Qui descriviamo un protocollo per l’implementazione del sistema di controllo remoto (Reversible Modifica of Transcription Endogenous loci), che consente un controllo reversibile e sintonizzabile l’espressione di un sistemi modello gene endogeno di interesse nella vita. Il sistema di controllo remoto utilizza avanzata lac repressione e tet attivazione sistemi per raggiungere giù – o upregulation di un determinato gene all’interno di un unico sistema biologico. Repressione stretto può essere raggiunto da repressore associazione siti flessibilmente situati lontano a valle di un sito di inizio trascrizione inibendo l’allungamento della trascrizione. Upregulation robusto può essere raggiunto aumentando la trascrizione di un gene endogeno prendendo di mira il attivatori trascrizionali tet al promotore cognato. Questo controllo di espressione reversibile e sintonizzabile può essere applicato e ritirato ripetutamente negli organismi. La potenza e la versatilità del sistema, come dimostrato per endogena Dnmt1 qui, vi permetterà più precisare analisi funzionale in vivo consentendo indagini di funzione del gene a vari livelli di espressione e verificando la reversibilità di un fenotipo.
Knockout genetica o approcci transgenici sono stati efficaci mezzi per studiare la funzione del gene in modelli animali. Tuttavia, la regolazione dell’espressione di questi approcci è dicotomica (acceso/spento), non-temporale e quindi non è in grado di rivelare lo spettro completo e funzionale di un gene. Condizionale Cre/LoxP tecnologie hanno permesso spazio-temporali inattivazione o l’attivazione della funzione del gene, ma la loro natura dicotomica continua a porre limitazioni, quali cella letalità e irreversibilità1,2 , 3. al fine di riempire questo vuoto, condizionali atterramento approcci sono stati sviluppati utilizzando tet-regolato shRNA o miRNA4. Tuttavia, fuori bersaglio effetti rimangono una preoccupazione per RNAi5 e sono stato impegnativo per controllare in vivo. Più recentemente, tecnologie di controllo trascrizionale mediata da CRISPR e Cas hanno introdotto un approccio più versatile per raggiungere up – e downregulation dell’espressione del gene endogeno e hanno dimostrato la loro utilità6,7 . Tuttavia, l’efficacia del controllo trascrizionale mediata da CRISPR e Cas è ancora chiaro in vivo e la reversibilità della repressione basata su KRAB rimane per essere visto, come forte repressione da KRAB e sua proteina interagente KAP1 è stato indicato per indurre 8,9il silenziamento genico permanente.
Per risolvere queste limitazioni, abbiamo sviluppato un nuovo sistema di regolamentazione trascrizionale in grado di controllare in modo condizionale espressione genica endogena in un reversibile e sintonizzabile modo nei topi utilizzando progettato procariotica binario trascrizionale sistemi di regolamentazione10. Prokaryotic binari sistemi normativi trascrizionale con ligandi di regolamentazione, come lac e tet, hanno permesso tali reversibile e sintonizzabile espressione controllo11,12,13, 14. Tuttavia, la potenza di repressione inadeguato il sistema binario corrente ha impedito loro l’adozione per controllo dell’espressione genica endogena nei mammiferi. Abbiamo sviluppato un sistema di repressione lac avanzata sufficientemente potente per la repressione di geni endogeni e impiegato una nuova strategia di targeting tet attivatori trascrizionali direttamente al cognate promotore di un gene endogeno per raggiungere upregulation robusto (Figura 1)10. Con questa tecnologia, abbiamo raggiunto quasi due ordini di grandezza controllo di espressione del gene endogeno Dnmt1 in un modo sintonizzabile, viscoelastico e reversibile10. Qui forniamo istruzioni dettagliate per la sua applicazione in vivo ad altri geni e organismi utilizzando topi come una specie di modello.
Figura 1 : Panoramica del sistema di controllo remoto. La trascrizione di un gene target endogeni può essere regolata utilizzando derivati dal lac repressore e sistemi di attivatore di tet . Il promotore del gene bersaglio o introne è progettato per contenere operatori per il repressore LacIGY tight binding e/o rtattivatore TA-M2. R indica Repron (Repression intrin), che contiene 12 operatori lac simmetrica (S) più un introne di beta-globina coniglio parziale. T indica l’operatore di tet . Il repressore e/o attivatore è/sono espressi da un promotore tessuto-specifica. L’espressione del gene dell’obiettivo può quindi essere sintonizzato reversibilmente al livello di espressione desiderata dall’amministrazione di IPTG (isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside, un antagonista del repressore di LacIGY) o doxiciclina (Dox). Questa figura è stata modificata da Lee et al.10fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Prima di iniziare questo protocollo, esaminare la tabella 1 per identificare le operazioni rilevanti per il controllo desiderato dell’espressione genica. Ad esempio, per progettare un mouse che consente reversibile downregulation di “Gene X”, completare sezioni 1, 3 e 4 del sotto protocollo. La tabella 1 riassume anche i componenti necessari del sistema di controllo remoto.
Cambiamento di espressione desiderata | Repressione solo | Attivazione solo | Sia di repressione e di attivazione |
Sezioni pertinenti del protocollo | 1, 3-4 | 2-4 | 1-4 |
Telecomando sequenza necessaria nel Gene Target | Repron (“Introne repressione”; 12 operatori lac simmetrico più un introne di beta-globina coniglio parziale) | Tet all’operatore | All’operatore Repron e Tet |
Posizione di sequenza telecomando | Introne | Promotore | Introne & Promoter |
Attivatore/repressore necessari per controllo desiderato | LacIGY repressore | Attivatore di rtTA-M2 | LacIGY repressore e attivatore rtTA-M2 |
Ligandi normativi | IPTG | Doxiciclina | IPTG e/o doxiciclina |
Tabella 1: Panoramica di componenti di controllo remoto.
Un passaggio fondamentale e limitazione potenziale del sistema di controllo remoto è la sfida connessa con l’inserimento di repressore e/o siti di legame di attivatore senza alterare l’espressione genica. Il nostro approccio originale di repressione, come applicata al gene Dnmt1 , coinvolti inserimento di siti di legame di repressore lac all’interno di regioni trascrizionalmente critiche di un promotore. Al fine di ridurre il rischio di intaccare la funzione di promotore e quindi di migliorare l’applicabilità generale del sistema di controllo remoto, abbiamo sviluppato un approccio basato su introne repressione. La potenza del nostro sistema avanzata lac ci ha permesso di strettamente reprimere la trascrizione di tutti i promotori forti abbiamo testato presso operatori situati centinaia di parecchi kilobasi a valle della trascrizione avvia siti (Figura 3A – C) 10. d’importanza, i livelli di repressione erano indipendenti dei punti di forza trascrizionale dei promotori (Figura 3A – C)10. Ciò suggerisce che la capacità di repressione del nostro sistema basato su introne repressione supera la forza trascrizionale dei promotori testati. In questo approccio basato su introne, è probabile che la repressione è mediata attraverso interferenze fisiche tra due componenti, il macchinario di allungamento della trascrizione e il lac repressori57. Questo meccanismo semplice repressione e l’affidabilità dimostrata del metodo basato su introne possono rendere questo approccio generalmente applicabile ad organismi, tessuti e geni differenti.
Il upregulation del sistema di controllo remoto richiede le sequenze di associazione transactivator di essere in prossimità del promotore del gene di destinazione, che comporta un rischio di intaccare la funzione di promotore. Tuttavia, abbiamo trovato che la posizione di sequenze di associazione può essere di fuori della regione critica trascrizionalmente. Promotori sia Dnmt1 ed EF1α erano robustamente sovraregolati da tet operatori si trovano un paio di centinaia di basi a Monte della trascrizione inizio siti10. Questo vincolo rilassato riduce notevolmente la possibilità di pregiudicare la funzione di promotore di un gene bersaglio in assenza del transactivator. Aumentando il numero di associazione sequenze e/o uso di transactivators più forte potrebbe contribuire a ridurre ulteriormente il rischio attivando upregulation da siti più lontano il sito di inizio della trascrizione.
Il nostro sistema di controllo remoto fornisce elegante controllo dei livello, il tempismo e la posizione dell’espressione genica endogena, consentendo per testare la reversibilità di un fenotipo e le conseguenze dei livelli di espressione diversa, che non sono facilmente ottenibili da attuali tecnologie di controllo di espressione genica in vivo. È importante notare che nella maggior parte delle analisi di espressione genica, compreso il nostro, espressione valori rappresentano la media di una popolazione di cellule tra cui considerevole variazione può essere trovata. Questa eterogeneità può influenzare i processi decisionali cellulari, come differenziazione o apoptosi58. Anche se la precisione del controllo di espressione genica potrebbe probabilmente essere ulteriormente migliorata da ulteriori circuito genetico ingegneria59, la potenza osservata del nostro attuale sistema permetterà utile indagine della funzione genica in molti contesti biologici. Inoltre, un elevato grado di specificità di bersaglio è previsto a causa della complessità delle sequenze di operatore, nonché la grande distanza evolutiva tra mammiferi e le specie di origine dei componenti regolatori60. Inoltre, linee di topi transgenici di attivatori e repressori possono essere sviluppate e utilizzate per qualsiasi gene endogeno. Ad esempio, modelli di mouse transactivator tet esistenti possono essere adattati per compire il upregulation di un determinato gene nei tessuti del mouse desiderato. Abbiamo recentemente sviluppato una linea transgenica che può guidare robusta espressione tessuto-specifica del nostro repressore lac rafforzata in diversi tipi di tessuto quando combinato con linee di Cre esistenti introducendo il gene lacIGY nel locus Hipp11 48 sotto il controllo di un elemento di Lox-STOP-Lox (non pubblicato). Questa linea sarebbe sostanzialmente facilitare l’applicazione di tessuto-specifica del sistema di controllo remoto.
Upregulation di gene dal sistema di controllo remoto fornisce diversi vantaggi rispetto alle attuali approcci transgenici inducibili. Non richiede la generazione di più linee transgeniche per testare gli effetti di posizione dell’inserzione, poiché utilizza il locus endogeno. Inoltre, questo approccio è adatto upregulation dei geni con espressione basale forte perché migliora l’espressione da un promotore già robusto, considerando che modelli transgenici convenzionali si basano su minimi promotori virali. Infine, il tessuto specificità, controllo del ciclo cellulare e varianti di geni bersaglio di splicing possono essere conservati su upregulation dal nostro approccio, cui conserva elementi di regolazione naturale come innata cis-elementi regolatori. L’avvento della tecnologia di gene-targeting CRISPR/Cas-mediata agevolerà notevolmente l’applicazione di questa tecnologia in sistemi modello diversi.
The authors have nothing to disclose.
Ringraziamo il tardo Dr Heidi Scrable per suo generoso dono del costrutto gene lacI mammiferi (Mayo Clinic, Rochester, MN), Dr Daniel Louvard (Institut Curie, Parigi, Francia) per fornire il promotore di villina e Dr Laurie Jackson-Grusby (ospedale pediatrico, Boston, MA) per i suoi contributi alle prime fasi di questo sviluppo di tecnologia. Siamo grati per Dr Nancy Wu e Dr Robert Maxson per la loro assistenza nella generazione di topi transgenici e knockoui. Si ringraziano i membri del laboratorio Laird per utili discussioni e supporto. Questo lavoro è stato supportato dal National Institutes of Health [CA75090 R01, DA030325 R01, CA157918 R01 e R01 CA212374 a p.w.l. e 1F31CA213897-01A1 a N.A.V.S].
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