इस प्रोटोकॉल में एक मॉडल प्रणाली है जिसमें ब्याज की एक अंतर्जात जीन के प्रतिलेखन जीवित जानवरों या कोशिकाओं में बढ़ाया लाख दमनकारी और/या tet उत्प्रेरक प्रणालियों का उपयोग कर सशर्त नियंत्रित किया जा सकता है उत्पंन करने के लिए आवश्यक कदम की रूपरेखा ।
यहां हम दूरदराज के नियंत्रण प्रणाली को लागू करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन (रीversible एमanipulation ओएफ टीरैंसक्रिप्शन ईndogenous loci पर), जो एक के प्रतिवर्ती और स्वरित्र अभिव्यक्ति नियंत्रण के लिए अनुमति देता है रहने वाले मॉडल सिस्टम में ब्याज की अंतर्जात जीन । रिमोट कंट्रोल सिस्टम एक एकल जैविक प्रणाली के भीतर एक लक्ष्य जीन के नीचे-या upregulation प्राप्त करने के लिए बढ़ाया लाख दमन और टीईटी सक्रियण प्रणाली को रोजगार । तंग दमन दबानेवाला बंधन साइटों flexibly से दूर अनुप्रवाह एक ट्रांसक्रिप्शन शुरू करने के लिए प्रतिलेखन बढ़ाव के द्वारा साइट के डाउनस्ट्रीम स्थित से प्राप्त किया जा सकता है । मजबूत यूपरेग्लेशन को एक अंतर्जात जीन के प्रतिलेखन को बढ़ाने के द्वारा प्राप्त किया जा सकता है जो कि संजात प्रवर्तक को टीईटी परिसंक्रियक उत्प्रेरक को लक्षित करता है । इस प्रतिवर्ती और तुनीय अभिव्यक्ति नियंत्रण को लागू किया जा सकता है और जीवों में बार वापस ले लिया । शक्ति और प्रणाली के बहुमुखी प्रतिभा, के रूप में अंतर्जात Dnmt1 यहां के लिए प्रदर्शन किया, और विभिंन अभिव्यक्ति के स्तर पर जीन समारोह की जांच को सक्षम करने से vivo कार्यात्मक विश्लेषण में और अधिक सटीक अनुमति देगा एक की प्रतिवर्त्यता परीक्षण द्वारा Phenotype.
जेनेटिक नॉकआउट या ट्रांसजेनिक दृष्टिकोण प्रभावी तरीके से पशु मॉडलों में जीन समारोह का अध्ययन किया गया है । तथापि, इन दृष्टिकोणों द्वारा अभिव्यक्ति विनियम, गैर-लौकिक, और इस प्रकार एक जीन के पूर्ण कार्यात्मक स्पेक्ट्रम का खुलासा करने में सक्षम नहीं है । सशर्त Cre/LOxp प्रौद्योगिकियों spatio-लौकिक inactivation या जीन समारोह के सक्रियण की अनुमति दी है, लेकिन उनकी द्विभाजी प्रकृति के लिए सीमाओं की तरह जारी है, सेल lethality और अपरिवर्तिता1,2 , 3. इस शूंय को भरने के लिए, सशर्त पछाड़ना दृष्टिकोण tetका उपयोग कर विकसित किया गया है-विनियमित shrna या mirna4। हालांकि, बंद लक्ष्य प्रभाव RNAi5 के लिए एक चिंता का विषय बने रहते हैं और vivo में नियंत्रण करने के लिए चुनौतीपूर्ण है. हाल ही में, crispr/Cas-mediated transcriptional-नियंत्रण प्रौद्योगिकियों दोनों को प्राप्त करने और अंतर्जात जीन अभिव्यक्ति के downregulation के लिए एक अधिक बहुमुखी दृष्टिकोण शुरू की है और अपनी उपयोगिताओं का प्रदर्शन किया6,7 . हालांकि, crispr/Cas-mediated transcriptional नियंत्रण की प्रभावशीलता के रूप में अभी तक vivo में अस्पष्ट है, और krab के प्रतिवर्त्यता-दमन आधारित है देखा जा करने के लिए, krab और उसके बातचीत प्रोटीन KAP1 द्वारा मजबूत दमन के रूप में प्रेरित दिखाया गया है स्थायी जीन साइलेंसिंग८,९.
इन सीमाओं को संबोधित करने के लिए, हम एक उपंयास transcriptional नियामक प्रणाली विकसित किया है सशर्त नियंत्रित करने में सक्षम अंतर्जात जीन अभिव्यक्ति एक प्रतिवर्ती और स्वरित्र तरीके में चूहों में इंजीनियर प्रोकार्योटिक द्विआधारी transअपंग का उपयोग नियामक प्रणालियां10. प्रोक्योटिक द्विआधारी विनियामकीय नियामक प्रणाली, जैसे कि एलएसी और टीईटी, ने ऐसी प्रतिवर्ती और तुनीय अभिव्यक्ति को सक्षम किया है नियंत्रण11,12,13, 14. तथापि, वर्तमान द्विआधारी प्रणालियों के अपर्याप्त दमन शक्ति स्तनधारियों में अंतर्जात जीन अभिव्यक्ति को नियंत्रित करने के लिए अपने व्यापक अपनाने बाधित है । हम एक बढ़ाया लाख दमन प्रणाली अंतर्जात जीन के दमन के लिए पर्याप्त रूप से शक्तिशाली विकसित की है और एक अंतर्जात जीन के सजात प्रमोटर को प्राप्त करने के लिए tet transcriptional activators सीधे लक्ष्यीकरण की एक उपंयास रणनीति कार्यरत दमदार यूपरेग्लेशन (चित्रा 1)10. इस तकनीक के साथ, हम लगभग दो आदेश प्राप्त की है परिमाण अभिव्यक्ति नियंत्रण अंतर्जात Dnmt1 जीन के एक tunable में, inducible, और प्रतिवर्ती तरीके से10। यहाँ हम एक मॉडल प्रजाति के रूप में चूहों का उपयोग अन्य जीन और जीवों के लिए vivo आवेदन में इसके लिए कदम दर कदम निर्देश प्रदान करते हैं.
चित्रा 1 : दूरस्थ नियंत्रण सिस्टम का ओवरव्यू । अंतर्जात लक्ष्य जीन के प्रतिलेखन को इंजीनियर लाख रप्रेसर और tet उत्प्रेरक प्रणालियों का उपयोग करके विनियमित किया जा सकता है । लक्ष्य जीन प्रमोटर या intron तंग बाध्यकारी LacIGY दमित और/या आरटीटीए M2 उत्प्रेरक के लिए ऑपरेटरों को नियंत्रित करने के लिए इंजीनियर है । R इंगित करता है Repron (प्रतिनिधिression intrपर), जिसमें 12 सममित lac ऑपरेटर्स (S) प्लस एक आंशिक खरगोश बीटा-ग्लोबिन intron शामिल हैं । T tet ऑपरेटर इंगित करता है । प्रतिकारक और/या उत्प्रेरक एक ऊतक विशिष्ट प्रमोटर से व्यक्त किया जाता है । लक्ष्य जीन की अभिव्यक्ति तो reversibly IPTG के प्रशासन द्वारा वांछित अभिव्यक्ति स्तर को देखते किया जा सकता है (isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside, LacIGY दबानेवाला का एक विरोधी) या Doxycycline (Dox) । यह आंकड़ा ली एट अल.10से संशोधित किया गया हैकृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
इस प्रोटोकॉल को प्रारंभ करने से पहले, जीन व्यंजक के वांछित नियंत्रण के लिए प्रासंगिक चरणों की पहचान करने के लिए तालिका 1 की समीक्षा करें. उदाहरण के लिए, एक माउस इंजीनियर है कि “जीन एक्स” के प्रतिवर्ती downregulation सक्षम बनाता है, पूरा अनुभाग 1, 3, और नीचे प्रोटोकॉल के 4 । तालिका 1 दूरस्थ नियंत्रण सिस्टम के आवश्यक घटकों को भी सारांशित करती है ।
वांछित अभिव्यक्ति परिवर्तन | दमन ही | केवल सक्रियण | दमन और सक्रियण दोनों |
प्रोटोकॉल के प्रासंगिक अनुभागों | 1, 3-4 | 2-4 | 1-4 |
लक्ष्य जीन में रिमोट कंट्रोल अनुक्रम की जरूरत | Repron (“दमन intron”; 12 सममित लाख ऑपरेटरों प्लस एक आंशिक खरगोश बीटा-globin intron) | Tet ऑपरेटर (s) | Repron और Tet ऑपरेटर (s) |
रिमोट कंट्रोल अनुक्रम स्थान | Intron | प्रमोटर | इंट्रॉन & प्रवर्तक |
वांछित नियंत्रण के लिए आवश्यक उत्प्रेरक/ | LacIGY रप्रेसर | rtTA-M2 उत्प्रेरक | LacIGY रप्रेसर और rtTA-M2 उत्प्रेरक |
रेग्युलेटरी लिगंड्स | आईपीटीजी | Doxycycline | IPTG और/Doxycycline |
तालिका 1: दूरस्थ नियंत्रण घटकों का ओवरव्यू ।
एक महत्वपूर्ण कदम और दूरदराज के नियंत्रण प्रणाली की संभावित सीमा लक्ष्य जीन अभिव्यक्ति को प्रभावित किए बिना दमनकारी और/या उत्प्रेरक बाध्यकारी साइटों की प्रविष्टि के साथ जुड़े चुनौती है । हमारे मूल दमन दृष्टिकोण, के रूप में Dnmt1 जीन के लिए लागू है, एक प्रमोटर के transcritical tionally महत्वपूर्ण क्षेत्रों के भीतर lac दबानेवाला बंधन साइटों की प्रविष्टि शामिल है । आदेश में प्रमोटर समारोह को प्रभावित करने के जोखिम को कम करने के लिए और इस प्रकार रिमोट कंट्रोल सिस्टम के सामांय प्रयोज्यता में सुधार करने के लिए, हम एक intron आधारित दमन दृष्टिकोण विकसित की है । हमारे बढ़ाया lac प्रणाली की शक्ति हमें कसकर सभी मजबूत प्रमोटरों हम प्रतिलेखन शुरू साइटों की कई किलोबाइट डाउनस्ट्रीम करने के लिए सैकड़ों स्थित ऑपरेटरों पर परीक्षण के प्रतिलेखन दबाने के लिए अनुमति दी (चित्रा 3A-C) 10. महत्वपूर्ण बात, दमन के स्तर प्रवर्तकों की संक्रमणकारी ताकत से स्वतंत्र थे (चित्रा 3A-C)10. यह पता चलता है कि हमारे intron के दमन क्षमता आधारित दमन प्रणाली परीक्षण किया प्रमोटरों की अधिक से अधिक है । इस intron-आधारित दृष्टिकोण में, यह संभावना है कि दमन दो घटकों के बीच शारीरिक हस्तक्षेप के माध्यम से मध्यस्थता है, प्रतिलेखन बढ़ाव मशीनरी और लाख repressors५७. यह सरल दमन तंत्र और intron के प्रदर्शन मजबूती आधारित विधि यह दृष्टिकोण आम तौर पर विभिंन जीन, ऊतकों, और जीवों के लिए लागू कर सकते हैं ।
रिमोट कंट्रोल सिस्टम द्वारा upregulation के लिए transactivator बाध्यकारी अनुक्रम लक्ष्य जीन प्रमोटर, जो प्रमोटर समारोह को प्रभावित करने का खतरा जरूरत पर जोर देता है निकटता में होने की आवश्यकता है । हालांकि, हमने पाया है कि बाध्यकारी दृश्यों की स्थिति के बाहर हो सकता है transcriptionally महत्वपूर्ण क्षेत्र । Dnmt1 और EF1α दोनों प्रमोटरों को ट्रांसक्रिप्शन स्टार्ट साइट् स10के अपस्ट्रीम सौ ठिकानों के एक जोड़े में स्थित tet ऑपरेटरों से अलग किया गया था । यह आराम की बाधा बहुत transactivator के अभाव में एक लक्ष्य जीन के प्रमोटर समारोह को प्रभावित करने की संभावना को कम कर देता है । बाइंडिंग दृश्यों और/या मजबूत transactivators के उपयोग की संख्या में वृद्धि आगे transactivators शुरू साइट से दूर साइटों से upregulation को सक्षम करने से जोखिम को कम करने में मदद कर सकता है ।
हमारे रिमोट कंट्रोल सिस्टम के स्तर के सुरुचिपूर्ण नियंत्रण प्रदान करता है, समय, और अंतर्जात जीन अभिव्यक्ति के स्थान, एक phenotype की प्रतिवर्त्यता परीक्षण के लिए अनुमति देता है और विभिन्न अभिव्यक्ति के स्तर के परिणाम, जो आसानी से प्राप्त नहीं कर रहे हैं vivo जीन अभिव्यक्ति में वर्तमान-नियंत्रण प्रौद्योगिकियों । यह ध्यान दें कि सबसे जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण में हमारे सहित महत्वपूर्ण है, अभिव्यक्ति मूल्यों कोशिकाओं के बीच जो काफी भिंनता पाया जा सकता है की एक जनसंख्या के औसत का प्रतिनिधित्व करते हैं । इस विषमजनन सेलुलर निर्णय प्रक्रिया को प्रभावित कर सकते हैं, इस तरह के भेदभाव या apoptosis५८के रूप में । हालांकि जीन अभिव्यक्ति नियंत्रण की शुद्धता की संभावना आगे अतिरिक्त आनुवंशिक सर्किट इंजीनियरिंग५९द्वारा सुधार किया जा सकता है, हमारे वर्तमान प्रणाली के मनाया शक्ति कई जैविक संदर्भों में जीन समारोह की उपयोगी जांच की अनुमति होगी । इसके अलावा, लक्ष्य विशिष्टता का एक उच्च डिग्री क्योंकि ऑपरेटर दृश्यों की जटिलता के साथ ही स्तनधारियों और नियामक घटकों६०के उद्भव प्रजातियों के बीच बड़े विकासवादी दूरी की उंमीद है । इसके अलावा, ट्रांसजेनिक repressors और activators के माउस लाइनों और विकसित किया जा सकता है किसी भी अंतर्जात जीन के लिए कार्यरत हैं । उदाहरण के लिए, मौजूदा tet ट्रांसक्रिकेटर माउस मॉडल वांछित माउस ऊतकों में एक लक्ष्य जीन की upregulation को पूरा करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है । हम हाल ही में एक ट्रांसजेनिक लाइन है कि मजबूत ऊतक ड्राइव कर सकते है कई ऊतक प्रकार में हमारे बढ़ाया लाख दमन के विशिष्ट अभिव्यक्ति जब मौजूदा cre लाइनों के साथ Hipp11 लोकस ४८ में lacigy जीन शुरू करने के साथ संयुक्त विकसित एक lox-स्टॉप-lox तत्व (अप्रकाशित) के नियंत्रण के अंतर्गत । यह लाइन काफी हद तक रिमोट कंट्रोल सिस्टम के टिशू-विशिष्ट एप्लीकेशन को सुगम बनाएगी ।
दूरस्थ नियंत्रण प्रणाली द्वारा जीन उपरेगुलेशन वर्तमान inducible ट्रांसजेनिक दृष्टिकोण की तुलना में कई लाभ प्रदान करता है । यह कई ट्रांसजेनिक लाइनों के उत्पादन के लिए प्रविष्टि की स्थिति प्रभाव के लिए परीक्षण की आवश्यकता नहीं है, के रूप में यह अंतर्जात लोकस का इस्तेमाल करता है । इसके अतिरिक्त, यह दृष्टिकोण मजबूत आधारभूत अभिव्यक्ति के साथ जीन के upregulation के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है क्योंकि यह एक पहले से ही मजबूत प्रमोटर से अभिव्यक्ति को बढ़ाता है, जबकि पारंपरिक ट्रांसजेनिक मॉडल ंयूनतम वायरल प्रमोटरों पर भरोसा करते हैं । अंत में, ऊतक विशिष्टता, कोशिका चक्र नियंत्रण, और एक लक्ष्य जीन के splicing वेरिएंट हमारे दृष्टिकोण से upregulation पर बरकरार रखा जा सकता है, के रूप में यह प्राकृतिक विनियमन के तत्वों जैसे जंमजात सीआईएस-विनियामक तत्वों को बरकरार रखता है । CRISPR/Cas-mediated जीन-लक्ष्यीकरण प्रौद्योगिकी के आगमन से विविध मॉडल प्रणालियों में इस प्रौद्योगिकी के अनुप्रयोग को काफी सुविधा मिलेगी ।
The authors have nothing to disclose.
हम स्वर्गीय डॉ Heidi के स्तनधारी lacI जीन का निर्माण (मेयो क्लिनिक, रोचेस्टर, एमएन), डॉ डैनियल Louvard (Institut क्यूरी, पेरिस, फ्रांस) के विलिण प्रमोटर प्रदान करने के लिए उसे उदार उपहार के लिए धंयवाद Scrable, और Dr लॉरी जैक्सन-Grusby (बच्चों के अस्पताल, बोस्टन, एमए) इस प्रौद्योगिकी के विकास के प्रारंभिक दौर में उसके योगदान के लिए । हम डॉ नैंसी वू और डॉ रॉबर्ट Maxson के लिए आभारी है ट्रांसजेनिक और पीटकर चूहों पैदा करने में उनकी सहायता के लिए । हम उपयोगी विचार विमर्श और समर्थन के लिए Laird प्रयोगशाला के सदस्यों को धंयवाद । इस काम के स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों [R01 CA75090, R01 DA030325, R01 CA157918, और R01 CA212374 p.w.l. और 1F31CA213897-01A1 के लिए एन. ए. वी. एस] द्वारा समर्थित किया गया था ।
B6C3F1/J | The Jackson Laboratory | 100010 | https://www.jax.org/strain/100010 |
Cas9 Protein | PNA Bio | CP04 | http://www.pnabio.com/products/CRISPR_Cas9.htm?gclid=EAIaIQobChMIsoG8pLL33QIVBr7ACh0naQ4dEAAYAiAAEgKyHvD_BwE |
CRISPOR | Haeussler et al. 2016 | http://crispor.tefor.net/ | |
Doxycycline-Containing Mouse Diet | Envigo | Varies by concentration | https://www.envigo.com/products-services/teklad/laboratory-animal-diets/custom-research/doxycycline-diets/ |
ENCODE Database | Stanford University | https://www.encodeproject.org/ | |
iCre mRNA synthesis plasmid (pBBI) | Addgene | 65795 | https://www.addgene.org/65795/ |
IPTG | GoldBio | I2481C | https://www.goldbio.com/search?isSearch=Y&q=iptg |
pGL3-Basic | Promega | E1751 | https://www.promega.com/products/reporter-assays-and-transfection/reporter-vectors-and-cell-lines/pgl3-luciferase-reporter-vectors/?catNum=E1751 |
SVM-BPfinder | Regulatory Genomics, Pompeu Fabra University | http://regulatorygenomics.upf.edu/Software/SVM_BP/ | |
TiProD: Tissue specific promoter Database | Department of Bioinformatics, UMG, University of Göttingen | http://tiprod.bioinf.med.uni-goettingen.de | |
UCSC Genome Browser | University of California Santa Cruz | https://genome.ucsc.edu/ |