Denne protokol beskriver de nødvendige skridt for at generere en modelsystem hvor transkription af en endogen gen af interesse betinget kan styres i levende dyr eller celler ved hjælp af forbedrede lac repressor og/eller tet aktivator systemer.
Her beskriver vi en protokol for at gennemføre ordningen fjernbetjening (Reversible Manipulation of Transcription på Endogenous loci), som giver mulighed for reversible og afstemmelige udtryk kontrol af en endogene gen af interesse i levende model systemer. Fjernbetjening system beskæftiger udvidede lac undertrykkelse og tet aktivering systemer at opnå ned- eller Opregulering af et target gen inden for en enkelt biologisk system. Stram undertrykkelse kan opnås fra repressor bindende websteder fleksibelt beliggende langt neden for en transskription startsted ved at hæmme transskription brudforlængelse. Robust Opregulering kan nås ved at forbedre transskription af en endogen gen ved at målrette tet transcriptional aktivatorer til beslægtet initiativtageren. Denne reversible og afstemmelige udtryk kontrol kan anvendes og trukket tilbage gentagne gange i organismer. Styrken og alsidigheden i systemet, som demonstrerede for endogene Dnmt1 her, vil give mere præcise in vivo funktionelle analyser ved at aktivere undersøgelse af genfunktioner på forskellige udtryk og ved at teste reversibilitet af en fænotype.
Genetiske knockout eller transgene tilgange har været effektive midler til at studere genfunktion i dyremodeller. Dog udtryk regulering af disse tilgange er dikotome (tænd/sluk), ikke-temporale, og er således ikke i stand til at afsløre den komplette funktionelle spektrum af et gen. Betinget Cre/LoxP teknologier har tilladt spatio-temporale inaktivering eller aktivering af genfunktioner, men deres dikotome natur fortsat at udgøre begrænsninger, såsom celle dødelighed og uigenkaldelighed1,2 , 3. for at udfylde dette tomrum, betinget knockdown metoder er blevet udviklet ved hjælp af tet-reguleret shRNA eller miRNA4. Men ud-target effekter fortsat en bekymring for RNAi5 og har udfordrende for at styre in vivo. For nylig, CRISPR/Cas-medieret transcriptional-kontrol teknologier har indførte en mere alsidig tilgang til at opnå både op- og downregulation af endogene genekspression og demonstreret deres utilities6,7 . Dog, effektiviteten af CRISPR/Cas-medieret transcriptional kontrol er endnu uklart i vivo, og reversibiliteten af KRAB-baserede undertrykkelse mangler for at blive set, så stærk undertrykkelse af KRAB og dens interagerende protein KAP1 har vist sig at fremkalde permanent genhæmning8,9.
For at imødegå disse begrænsninger, har vi udviklet en roman transcriptional regulerende system kan betinget kontrollere endogene genekspression i en reversibel og afstemmelige måde i mus bruger manipuleret prokaryote binære transcriptional reguleringssystemer10. Prokaryote binære transcriptional reguleringssystemer med regulerende ligander såsom lac og tet, har aktiveret sådan reversible og afstemmelige udtryk styre11,12,13, 14. imidlertid den utilstrækkelige undertrykkelse styrken af de aktuelle binære systemer har hæmmet deres brede vedtagelse for at kontrollere endogene genekspression hos pattedyr. Vi udviklet en forbedret lac undertrykkelse system tilstrækkeligt potent til undertrykkelse af endogene gener og ansat en roman strategi rettet mod tet transcriptional aktivatorer direkte til den beslægtet fortaler for en endogen gen at opnå robust Opregulering (figur 1)10. Med denne teknologi, har vi opnået næsten to størrelsesordener udtryk kontrol af den endogene Dnmt1 gen i en afstemmelige, inducerbar og reversibel måde10. Her giver vi trinvise instruktioner til stævningen in vivo til andre gener og organismer ved hjælp af mus som en model art.
Figur 1 : Oversigt over fjernbetjening systemet. Transskription af en endogen target gen kan reguleres ved hjælp af konstruerede lac repressor og tet aktivator systemer. Target gen promotor eller intron er udviklet til at indeholde operatorer for tight bindende LacIGY repressor og/eller rtTA-M2 aktivator. R angiver Repron (Repression intrpå), som indeholder 12 symmetrisk lac operatører (S) plus en delvis kanin beta-globin intron. T angiver tet operatør. Repressor og aktivator/udtrykkes fra en væv-specifikke promotor. Udtryk af target-genet kan derefter reversibelt tunet til det ønskede udtryk niveau af administration af IPTG (isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside, en antagonist af LacIGY repressor) eller doxycyclin (Dox). Dette tal er blevet ændret fra Lee et al.10venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Før du begynder denne protokol, anmeld tabel 1 for at identificere de relevante trin for den ønskede kontrol af genekspression. For eksempel for at ingeniør en mus, der muliggør reversibel downregulation af “Gen X”, udfylde rubrik 1, 3 og 4 i den nedenfor protokol. Tabel 1 også opsummerer de nødvendige komponenter til fjernbetjening systemet.
Ønskede udtryk ændring | Undertrykkelse kun | Aktivering kun | Både undertrykkelse og aktivering |
Relevante dele af protokollen | 1, 3-4 | 2-4 | 1-4 |
Fjernbetjening sekvens i Target gen | Repron (“Undertrykkelse intron”; 12 symmetrisk lac operatører plus en delvis kanin beta-globin intron) | Tet operatører | Repron og Tet operatører |
Fjernbetjening sekvens placering | Intron | Promotor | Intron & promotor |
Aktivator/Repressor behov for ønskede kontrol | LacIGY Repressor | rtTA-M2 aktivator | LacIGY Repressor og rtTA-M2 aktivator |
Regulerende ligander | IPTG | Doxycyclin | IPTG og/eller doxycyklin |
Tabel 1: Oversigt over fjernbetjening komponenter.
Et kritisk trin og potentielle begrænsning af fjernbetjening systemet er udfordringen forbundet med indsættelse af repressor og/eller aktivator bindingssteder uden at påvirke målet genekspression. Vores oprindelige undertrykkelse tilgang, involveret som anvendes til Dnmt1 -gen indsættelse af lac repressor bindingssteder i transcriptionally kritiske regioner af en promotor. For at mindske risikoen for påvirker promotor funktion og dermed til at forbedre den almene gyldighed af fjernbetjening system, vi udviklede en intron-baserede undertrykkelse tilgang. Styrken af vores forbedrede lac systemet tillod os at stramt undertrykke transkription af alle stærke initiativtagerne vi testet på operatører ligger flere hundrede til flere kilobases nedstrøms i transkription starte websteder (fig. 3A-C) 10. vigtigere, undertrykkelse var uafhængig af de transkriptionel styrker af initiativtagere (fig. 3A-C)10. Dette tyder på at undertrykkelse af vores intron-baserede undertrykkelse ordning overstiger transcriptional styrken af de testede initiativtagere. I denne intron-baseret tilgang er det sandsynligt, at undertrykkelsen er medieret gennem fysiske interferens mellem to komponenter, transskription brudforlængelse maskiner og lac repressors57. Denne enkle undertrykkelse mekanisme og demonstreret robustheden af metoden intron-baserede kan gøre denne tilgang generelt gælder for forskellige gener, væv og organismer.
Opregulering af fjernbetjening systemet kræver transaktivatoren bindende sekvenser til at være i nærheden af target gen promotor, hvilket indebærer en risiko for at påvirke promotor funktion. Dog fandt vi, at placeringen af bindende sekvenser kan være uden for regionen transcriptionally kritisk. Både Dnmt1 og EF1α initiativtagerne var håndfast upregulated fra tet operatører ligger et par hundrede baser opstrøms transskription start sites10. Denne afslappet begrænsning reducerer chancen for at påvirke promotor funktion af et target gen i mangel af transaktivatoren. Øge antallet af bindende sekvenser og/eller brug af stærkere transactivators kunne hjælpe yderligere reducere risikoen ved at aktivere Opregulering fra steder længere væk fra startstedet transskription.
Vores fjernbetjening system giver elegante kontrol af niveau, timing og placering af endogene genekspression, giver mulighed for prøvning reversibilitet af en fænotype og konsekvenserne af forskellige udtryk niveauer, der ikke er let opnåeligt ved nuværende in vivo gen expression-adgangskontrol teknologier. Det er vigtigt at bemærke, at i de fleste gen expression analyser, herunder vores, udtryk værdier repræsenterer gennemsnittet af en population af celler blandt hvilke betydelig variation kan findes. Denne forskelligartethed kan påvirke cellulære beslutningsprocesser, såsom differentiering eller apoptose58. Selvom præcision af gen expression kontrol kunne sandsynligvis forbedres yderligere ved yderligere genetiske kredsløb engineering59, vil den observerede styrken af vores nuværende system give nyttige undersøgelse af genfunktioner i mange biologiske sammenhænge. Derudover forventes en høj grad af target specificitet på grund af operatør sekvenser samt store evolutionære afstanden mellem pattedyr og arternes oprindelse på den reguleringsmæssige komponenter60kompleksitet. Derudover kan Transgene mus linjer af repressors og aktivatorer udviklet og ansat for enhver endogene genet. For eksempel, kan eksisterende tet transaktivatoren musemodeller tilpasses for at udføre opregulering af et target gen i de ønskede mus væv. Vi har for nylig udviklet en transgene linje, der kan drive robust væv-specifikke udtryk for vores forbedrede lac repressor i flere vævstyper når de kombineres med eksisterende Cre linjer ved at indføre lacIGY -gen i Hipp11 locus48 under kontrol af en Lox-STOP-Lox element (upubliceret). Denne linje ville væsentligt lette væv-specifikke anvendelse af sen-kontrol-system.
Gen opregulering af fjernbetjening system giver adskillige fordele i forhold til nuværende inducerbar transgene tilgange. Det kræver ikke generation af flere transgene linjer til at teste for position virkningerne af indsættelsen, som det udnytter den endogene locus. Desuden, er denne fremgangsmåde velegnet til opregulering af gener med stærk baseline udtryk, fordi det øger udtryk fra en allerede robuste promotor, mens konventionelle transgene modeller er afhængige af minimal viral initiativtagere. Endelig væv specificitet, celle-cyklus kontrol og splejsning varianter af et target gen kan bevares ved opregulering af vores tilgang, da det bevarer elementer af naturlige regulering som medfødte cis-regulerende elementer. Fremkomsten af CRISPR/Cas-medieret gen-targeting teknologi vil i høj grad lette anvendelsen af denne teknologi i forskellige modelsystemer.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker den sene Dr. Heidi Scrable for hendes generøse gave af pattedyr lacI gen konstruktionen (Mayo Clinic, Rochester, MN), Dr. Daniel Louvard (Institut Curie, Paris, Frankrig) for at give Villin-promotor og Dr. Laurie Jackson-Grusby (children’s Hospital, Boston, MA) for hendes bidrag til de tidlige stadier af denne teknologiudvikling. Vi er taknemmelige for Dr Nancy Wu og Dr. Robert Maxson for deres bistand til at generere de transgene og knockout mus. Vi vil gerne takke medlemmerne af Laird laboratorium for nyttige diskussioner og støtte. Dette arbejde blev støttet af den National Institutes of Health [R01 CA75090 R01 DA030325, R01 CA157918 og R01 CA212374 til P.W.L. og 1F31CA213897-01A1 til N.A.V.S].
B6C3F1/J | The Jackson Laboratory | 100010 | https://www.jax.org/strain/100010 |
Cas9 Protein | PNA Bio | CP04 | http://www.pnabio.com/products/CRISPR_Cas9.htm?gclid=EAIaIQobChMIsoG8pLL33QIVBr7ACh0naQ4dEAAYAiAAEgKyHvD_BwE |
CRISPOR | Haeussler et al. 2016 | http://crispor.tefor.net/ | |
Doxycycline-Containing Mouse Diet | Envigo | Varies by concentration | https://www.envigo.com/products-services/teklad/laboratory-animal-diets/custom-research/doxycycline-diets/ |
ENCODE Database | Stanford University | https://www.encodeproject.org/ | |
iCre mRNA synthesis plasmid (pBBI) | Addgene | 65795 | https://www.addgene.org/65795/ |
IPTG | GoldBio | I2481C | https://www.goldbio.com/search?isSearch=Y&q=iptg |
pGL3-Basic | Promega | E1751 | https://www.promega.com/products/reporter-assays-and-transfection/reporter-vectors-and-cell-lines/pgl3-luciferase-reporter-vectors/?catNum=E1751 |
SVM-BPfinder | Regulatory Genomics, Pompeu Fabra University | http://regulatorygenomics.upf.edu/Software/SVM_BP/ | |
TiProD: Tissue specific promoter Database | Department of Bioinformatics, UMG, University of Göttingen | http://tiprod.bioinf.med.uni-goettingen.de | |
UCSC Genome Browser | University of California Santa Cruz | https://genome.ucsc.edu/ |