Studium der RNA Interaktoren des RNA während der Säugetier-Zelle Zyklus aktiviert Proteinkinase
Summary
Wir präsentieren experimentelle Ansätze für Studium RNA-Interaktoren des doppelsträngige RNA-bindende Proteinkinase RNA aktiviert (PKR) während des Säugetier-Zelle Zyklus mit HeLa-Zellen. Diese Methode nutzt Formaldehyd Crosslink RNA-PKR-komplexe und Immunopräzipitation PKR-gebundenen RNAs zu bereichern. Diese RNAs können weiter durch Hochdurchsatz-Sequenzierung oder qRT-PCR analysiert werden.
Abstract
Proteinkinase RNA aktiviert (PKR) ist ein Mitglied der angeborenen Immunantwort Proteine und erkennt die doppelsträngige Sekundärstruktur des viralen RNAs. Wenn virale doppelsträngige RNA (DsRNAs) verpflichtet, PKR Dimerisierung und anschließende Autophosphorylation erfährt. Phosphorylierten PKR (pPKR) wird aktiviert und induziert Phosphorylierung von der alpha-Untereinheit eukaryotic Initiation Factor 2 (eIF2α), globale Übersetzung zu unterdrücken. Erhöhung der Beweis schlägt vor, dass PKR unter physiologischen Bedingungen wie z. B. während des Zellzyklus oder unter verschiedenen Stressbedingungen ohne Infektion aktiviert werden kann. Unser Verständnis von der RNA-Aktivatoren von PKR ist jedoch aufgrund des Fehlens einer standardisierten experimentellen Methode zu erfassen und analysieren von PKR-wechselwirkenden DsRNAs beschränkt. Hier präsentieren wir ein experimentelles Protokoll gezielt anreichern und analysieren PKR gebunden RNAs während des Zellzyklus mit HeLa-Zellen. Wir nutzen die effiziente Vernetzung Aktivität von Formaldehyd zu PKR-RNA-komplexe zu beheben und über Immunopräzipitation zu isolieren. PKR-co-Immunoprecipitated-RNAs können dann weiterverarbeitet werden, um eine Bibliothek von Hochdurchsatz-Sequenzierung zu generieren. Eine wichtige Klasse von zellulären DsRNAs PKR-Interaktion ist mitochondriale RNAs (MtRNAs), die als intermolekulare DsRNAs durch ergänzende Zusammenspiel von Heavy-Strang und die Licht-Strang-RNA bestehen können. Um die Strandedness der dieser duplex MtRNAs zu untersuchen, stellen wir Ihnen auch ein Protokoll für Strang-spezifische qRT-PCR. Unser Protokoll ist für die Analyse von PKR-gebundenen RNAs optimiert, aber es kann leicht geändert werden, um zelluläre DsRNAs oder RNA-Interaktoren des anderen DsRNA-bindende Proteine zu studieren.
Introduction
Proteinkinase RNA aktiviert (PKR), auch bekannt als eukaryotic Initiation Faktor 2-Alpha Kinase 2 (EIF2AK2), ist ein gut charakterisierten Proteinkinase, die Informationen von RNAs überträgt. Es gehört zu den eukaryotic Übersetzung Einleitung 2 Untereinheit Alpha (eIF2α) Kinase Familie und phosphorylates eIF2α bei Serin 51 in Reaktion auf eine Infektion, globale Übersetzung1zu unterdrücken. In diesem Zusammenhang ist PKR durch virale doppelsträngige RNA (DsRNAs), aktiviert, die eine Plattform für PKR Dimerisierung und Autophosphorylation2zur Verfügung zu stellen. Neben eIF2α kann PKR auch c-Jun N-Terminal Kinase (JNK), Tätigkeit von zahlreichen Signal Transduction Bahnen3,4,5, Regeln, p53, Insulin-Rezeptor Substrat 1 und Inhibitor κB phosphorylieren 6.
PKR wurde ursprünglich als eine Kinase identifiziert, die eIF2α während der Poliovirus-Infektion phosphoryliert, durch das Poliovirus’ DsRNAs7,8erkennen. PKR findet sich zunehmend vielfältigen Rollen über Immunantwort zu spielen und seine aberrante Aktivierung oder Störung wird in zahlreichen menschlichen Krankheiten impliziert. Aktiviert/Phosphorylated PKR (pPKR) ist häufig zu beobachten während der Apoptose und ist ein gemeinsames Merkmal von Patienten mit degenerativer Erkrankungen, vor allem neurodegenerativer Erkrankungen wie der Chorea Huntington, Parkinson und Alzheimer-Krankheit9 ,10,11,12,13. Darüber hinaus ist PKR unter verschiedenen Stressbedingungen wie metabolischer Stress und Hitze Schock14,15,16,17aktiviert. Auf der anderen Seite führt Hemmung der PKR erhöhten Zellproliferation und sogar maligne Transformation18,19. PKR-Funktion ist auch wichtig in der normalen Gehirnfunktion und während des Zellzyklus als das Niveau der pPKR ist während der M Phase20,21,22erhöht. In diesem Zusammenhang pPKR globale Übersetzung unterdrückt und bietet Hinweise zu wichtigen mitotischen Signalsysteme, die für die ordnungsgemäße Zellteilung20erforderlich sind. Darüber hinaus führte anhaltende Aktivierung von PKR G2/M-Phase Zellzyklus Festnahme in Chinese Hamster Eierstock23Zellen. Infolgedessen ist der Negative Feedback-Schleife zu gewährleisten schnelle Deaktivierung während M/G1 Übergang21PKR Phosphorylierung geregelt.
Trotz der breiten Palette von PKR-Funktion beschränkt sich unser Verständnis von PKR Aktivierung aufgrund des Fehlens eines standardisierten Hochdurchsatz-experimentellen Ansatzes zu erfassen und identifizieren von DsRNAs, die PKR aktivieren können. Frühere Studien haben gezeigt, dass PKR interagieren kann, mit DsRNAs gebildet durch zwei invertierten Alu Wiederholungen (IRAlus)20,24, sondern die Möglichkeit der Existenz von weiteren zellulären DsRNAs, die PKR während des Zellzyklus oder unter aktivieren können Stressbedingungen in menschlichen Zellen war unerforscht. Der konventionelle Ansatz bei der Identifizierung von RNA-Interaktoren des ein RNA-bindendes Protein (RBP) verwendet UV-Licht auf Crosslink RNA-RBP-komplexe25,26,27. Eine aktuelle Studie dieser UV-Vernetzung-Ansatz in einem Maus-System angewendet und festgestellt, dass die kleinen Nukleolus RNAs PKR Aktivierung während metabolischer Stress16regulieren können. Durch die Verwendung von hohen Vernetzungseffizienz von Formaldehyd, präsentierten wir eine andere Methode zum PKR-Interaktion RNAs während des Zellzyklus in HeLa Zellen28zu identifizieren. Ein ähnlicher Ansatz wurde angewandt, um andere DsRBPs wie Staufen und Drosha29,30,31zu studieren. Wir fanden, dass PKR mit verschiedenen Arten von nichtcodierender RNA interagieren kann, wie z. B. kurzes eingestreuten nuklearen Element (Sinus), lange nuklearen Element (Linie), Element endogene Retroviren (ERV) und sogar Alpha-Satelliten-RNAs durchsetzt. Darüber hinaus haben wir gezeigt, dass PKR welche Form intermolekulare DsRNAs durch ergänzende Zusammenspiel der Heavy-Strang und das Licht RNAs28Strang mit mitochondrialen RNAs (MtRNAs), interagieren kann. Eine kürzlich erschienenen Publikation unterstützt weiter unsere Daten, dass einige MtRNAs gibt es in einer duplex Formulars und DsRNA Sensoren wie Melanom Differenzierung-assoziierten Protein 5 induzieren Interferone32aktivieren können. Noch wichtiger ist, sind Ausdruck und subzelluläre Lokalisation der MtRNAs moduliert während des Zellzyklus und durch verschiedene Stressoren, die möglicherweise wichtig in ihrer Fähigkeit, PKR Aktivierung28zu regulieren.
In diesem Artikel präsentieren wir ein detailliertes Protokoll für eine neu entwickelte Formaldehyd Vernetzung und Immunopräzipitation (fCLIP) Methode zum erfassen und analysieren von PKR-Interaktion RNAs während des Zellzyklus. Wir zeigen die Methode zum Zellzyklus Festnahme Proben mit Thymidin und Nocodazole vorzubereiten. Dann präsentieren wir Ihnen den fCLIP Prozess um PKR-gebundenen RNAs und eine Methode zur Vorbereitung von Hochdurchsatz-Sequenzierung Bibliothek, um diese RNAs zu identifizieren zu isolieren. Darüber hinaus beschreiben wir detaillierte Verfahren zur PKR-gebundenen RNA mittels qRT-PCR Analyse. Insbesondere stellen wir ein Strang-spezifische reversen Transkription Verfahren um die Strandedness des MtRNAs zu analysieren. Das beschriebene Protokoll für HeLa-Zellen und PKR optimiert ist, aber wichtige Schritte wie die Vorbereitung des Zellzyklus Probe, fCLIP und Strang-spezifische qRT-PCR-Analyse können einfach geändert werden, um zelluläre DsRNAs studieren oder RNA Interaktoren des anderen DsRBPs identifizieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Der Prozess, S oder M Phase verhaftet Proben vorzubereiten ist in Abbildung 1dargestellt. Um Zellen in der S-Phase zu verhaften, verwendeten wir eine Thymidin-Doppelblock-Methode wo wir behandelten Zellen mit Thymidin zweimal mit einem 9 h Release dazwischen zu hohen Verhaftung Effizienz (Abbildung 1A). Für M-Phase-Verhaftung, behandelten wir Zellen einmal mit Thymidin gefolgt von einem Release 9 h und dann Nocodazole auf Block-Zellen bei prometaphase (<strong …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch grundlegende Wissenschaft Forschungsprogramm durch die National Research Foundation von Korea (NRF) finanziert durch die koreanische Regierung Ministerium für Wissenschaft und IKT (NRF-2016R1C1B2009886) unterstützt.
Materials
| 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | AM9260G | |
| 1 M Tris, pH 7.0 | Thermo Fisher Scientific | AM9855G | |
| 1 M Tris, pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | AM9855G | |
| 1.7 mL microcentrifuge tube | Axygen | MCT-175-C | |
| 10% Nonidet-p40 (NP-40) | Biosolution | BN015 | |
| 10% Urea-acrylamide gel solution | 7 M (w/v) Urea and 0.5X TBE, stored protected from light at 4 °C | ||
| 10X DNA loading buffer | TaKaRa | 9157 | |
| 15 mL conical tube | SPL | 50015 | |
| 3' adaptor | 5'-rApp NN NNT GGA ATT CTC GGG TGC CAA GG/3ddC/-3' | ||
| 3 M Sodium Acetate pH 5.5 | Thermo Fisher Scientific | AM9740 | |
| 5' adaptor | 5'-GUU CAG AGU UCU ACA GUC CGA CGA UCN NNN-3' | ||
| 5 M NaCl | Thermo Fisher Scientific | AM9760G | |
| 50 mL conical tube | SPL | 50050 | |
| Acid-phenol chloroform, pH 4.5 | Thermo Fisher Scientific | AM9722 | |
| Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter | A63881 | Magnetic beads DNA/RNA clean up |
| Antarctic alkaline phosphatase | New England Biolabs | M0289S | |
| Anti-DGCR8 | Made in house | ||
| Anti-PKR (D7F7) | Cell signaling technology | 12297S | |
| Anti-PKR (Milli) | Millipore EMD | 07-151 | |
| ATP (100 mM) | GE Healthcare | GE27-2056-01 | |
| Bromophenol blue sodium salt | Sigma-aldrich | B5525 | |
| Calf intestinal alkaline phosphatase | TaKaRa | 2250A | |
| Cell scraper 25 cm 2-position | Sarstedt | 83.183 | |
| CMV promoter sequence | 5'-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3' | ||
| Dulbecco's modified eagle medium | Welgene | LM001-05 | |
| dNTP mixture (2.5 mM) | TaKaRa | 4030 | |
| Ethanol, Absolute, ACS Grade | Alfa-Aesar | A9951 | |
| Fetal bovine serum | Merck | M-TMS-013-BKR | |
| Formamide | Merck | 104008 | |
| Glycine | Bio-basic | GB0235 | |
| GlycoBlue coprecipitant (15 mg/mL) | Thermo Fisher Scientific | AM9516 | |
| Isopropanol | Merck | 8.18766.1000 | |
| NEBNext rRNA Depletion Kit | New England Biolabs | E6318 | rRNA Depletion Kit |
| Nocodazole | Sigma-Aldrich | M1404 | |
| Normal rabbit IgG | Cell signaling technology | 2729S | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 6148 | |
| PCR forward primer (RP1) | 5'-AAT GAT ACG GCG ACC ACC GCG ATC TAC ACG TTC AGA GTT CTA CAG TCC GA-3' | ||
| PCR index reverse primer (RPI) | 5'-CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA GAT NNN NNN GTG ACT GGA GTT CCT TGG CAC CCG AGA ATT CCA-3' | ||
| PCR tubes with flat cap, 0.2 mL | Axygen | PCR-02-C | |
| Phosphate bufered saline (PBS) Tablet | TaKaRa | T9181 | |
| Phusion high-fidelity DNA polymerase | New England Biolabs | M0530 | High-fidelity polymerase |
| PlateFuge microcentrifuge with swing-out rotor | Benchmark | c2000 | |
| Polynucleotide kinase (PNK) | TaKaRa | 2021A | |
| Protease inhibitor cocktail set III | Merck | 535140-1MLCN | |
| Proteinase K, recombinant, PCR Grade | Sigma-Aldrich | 3115879001 | |
| qPCR primer sequence: CO1 Heavy | Forward/Reverse: 5′-GCCATAACCCAATACCAAACG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: CO1 Light | Forward/Reverse: 5′-TTGAGGTTGCGGTCTGTTAG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: CO2 Heavy | Forward/Reverse: 5′-CTAGTCCTGTATGCCCTTTTCC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: CO2 Light | Forward/Reverse: 5′-GTAAAGGATGCGTAGGGATGG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
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| qPCR primer sequence: CO3 Light | Forward/Reverse: 5′-CTCCTGATGCGAGTAATACGG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
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| qPCR primer sequence: ND6 Light | Forward/Reverse: 5′-TGCTGTGGGTGAAAGAGTATG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| Random hexamer | Thermo Fisher Scientific | SO142 | |
| Recombinant Dnase I (Rnase-free) (5 U/μL) | TaKaRa | 2270A | |
| Recombinant Rnase inhibitor (40 U/μL) | TaKaRa | 2313A | |
| Ribo-Zero rRNA Removal Kit | Illumina | MRZH116 | rRNA Removal Kit |
| Rotator | FINEPCR, ROTATOR AG | D1.5-32 | |
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| RT primer sequence: CO1 Light | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGCCATAACCCAATACCAAACG-3′ | ||
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| RT primer sequence: CO2 Light | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCTAGTCCTGTATGCCCTTTTCC-3′ | ||
| RT primer sequence: CO3 Heavy | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCTCCTGATGCGAGTAATACGG-3′ | ||
| RT primer sequence: CO3 Light | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCCTTTTACCACTCCAGCCTAG-3′ | ||
| RT primer sequence: CYTB Heavy | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGGATAGTAATAGGGCAAGGACG-3′ | ||
| RT primer sequence: CYTB Light | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCAATTATACCCTAGCCAACCCC-3′ | ||
| RT primer sequence: GAPDH | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTGAGCGATGTGGCTCGGCT-3′ | ||
| RT primer sequence: ND1 Heavy | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGTTGTGATAAGGGTGGAGAGG-3′ | ||
| RT primer sequence: ND1 Light | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTCAAACTCAAACTACGCCCTG-3′ | ||
| RT primer sequence: ND4 Heavy | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTGTTTGTCGTAGGCAGATGG-3′ | ||
| RT primer sequence: ND4 Light | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCCTCACACTCATTCTCAACCC-3′ | ||
| RT primer sequence: ND5 Heavy | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTTTGGGTTGAGGTGATGATG-3′ | ||
| RT primer sequence: ND5 Light | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCATTGTCGCATCCACCTTTA-3′ | ||
| RT primer sequence: ND6 Heavy | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGGTTGAGGTCTTGGTGAGTG-3′ | ||
| RT primer sequence: ND6 Light | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCCCATAATCATACAAAGCCCC-3′ | ||
| Siliconized polypropylene 1.5 mL G-tube | Bio Plas | 4167SLS50 | |
| Sodium dedecyl sulfate | Biosesang | S1010 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| SUPERase In Rnase inhibitor | Thermo Fisher Scientific | AM2694 | |
| SuperScript III reverse transcriptase | Thermo Fisher Scientific | 18080093 | Reverse transcriptase for library preparation |
| SuperScript IV reverse transcriptase | Thermo Fisher Scientific | 18090010 | Reverse transcriptase for qRT-PCR |
| SYBR gold nucleic acid gl stain | Thermo Fisher Scientific | S11494 | |
| T4 polynucleotide kinase | New England Biolabs | M0201S | |
| T4 RNA ligase 1 (ssRNA Ligase) | New England Biolabs | M0204 | |
| T4 RNA ligase 2, truncated KQ | New England Biolabs | M0373 | |
| Thermomixer | Eppendorf ThermoMixer C with ThermoTop | ||
| Thymidine | Sigma-Aldrich | T9250 | |
| Tris-borate-EDTA buffer (TBE) | TaKara | T9122 | |
| Triton X-100 | Promega | H5142 | |
| Ultralink Protein A sepharose beads | Thermo Fisher Scientific | 22810 | Protein A beads |
| Ultrasonicator | Bioruptor | ||
| Urea | Bio-basic | UB0148 | |
| Vortex mixer | DAIHAN Scientific | VM-10 | |
| Xylene cyanol | Sigma-Aldrich | X4126 | |
| γ-32P-ATP (10 μCi/μL, 3.3 μM) | PerkinElmer | BLU502A100UC |
References
- Meurs, E. F., et al. Constitutive expression of human double-stranded RNA-activated p68 kinase in murine cells mediates phosphorylation of eukaryotic initiation factor 2 and partial resistance to encephalomyocarditis virus growth. Journal of Virology. 66 (10), 5805-5814 (1992).
- Patel, R. C., Stanton, P., McMillan, N. M., Williams, B. R., Sen, G. C. The interferon-inducible double-stranded RNA-activated protein kinase self-associates in vitro and in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (18), 8283-8287 (1995).
- Bennett, R. L., Pan, Y., Christian, J., Hui, T., May, W. S. The RAX/PACT-PKR stress response pathway promotes p53 sumoylation and activation, leading to G(1) arrest. Cell Cycle. 11 (1), 407-417 (2012).
- Yang, X., Nath, A., Opperman, M. J., Chan, C. The double-stranded RNA-dependent protein kinase differentially regulates insulin receptor substrates 1 and 2 in HepG2 cells. Molecular and Cellular Biology. 21 (19), 3449-3458 (2010).
- Zamanian-Daryoush, M., Mogensen, T. H., DiDonato, J. A., Williams, B. R. G. NF-kappa B Activation by Double-Stranded-RNA-Activated Protein Kinase (PKR) Is Mediated through NF-kappa B-Inducing Kinase and Ikappa B Kinase. Molecular and Cellular Biology. 20 (4), 1278-1290 (2000).
- Takada, Y., Ichikawa, H., Pataer, A., Swisher, S., Aggarwal, B. B. Genetic deletion of PKR abrogates TNF-induced activation of IkappaBalpha kinase. JNK, Akt and cell proliferation but potentiates p44/p42 MAPK and p38 MAPK activation. Oncogene. 26 (8), 1201-1212 (2007).
- Dabo, S., Meurs, E. F. dsRNA-dependent protein kinase PKR and its role in stress, signaling and HCV infection. Viruses. 4 (11), 2598-2635 (2012).
- Black, T. L., Safer, B., Hovanessian, A., Katze, M. G. The Cellular 68,000-Mr Protein-Kinase Is Highly Autophosphorylated and Activated yet Significantly Degraded during Poliovirus Infection – Implications for Translational Regulation. Journal of Virology. 63 (5), 2244-2251 (1989).
- Bando, Y., et al. Double-strand RNA dependent protein kinase (PKR) is involved in the extrastriatal degeneration in Parkinson’s disease and Huntington’s disease. Neurochemistry International. 46 (1), 11-18 (2005).
- Onuki, R., et al. An RNA-dependent protein kinase is involved in tunicamycin-induced apoptosis and Alzheimer’s disease. The EMBO Journal. 23 (4), 959-968 (2004).
- Peel, A. Activation of the cell stress kinase PKR in Alzheimer’s disease and human amyloid precursor protein transgenic mice. Neurobiology of Disease. 14 (1), 52-62 (2003).
- Peel, A. L. Double-stranded RNA-dependent protein kinase, PKR, binds preferentially to Huntington’s disease (HD) transcripts and is activated in HD tissue. Human Molecular Genetics. 10 (15), 1531-1538 (2001).
- Suen, K. C., Yu, M. S., So, K. F., Chang, R. C., Hugon, J. Upstream signaling pathways leading to the activation of double-stranded RNA-dependent serine/threonine protein kinase in beta-amyloid peptide neurotoxicity. Journal of biological chemistry. 278 (50), 49819-49827 (2003).
- Nakamura, T., et al. A critical role for PKR complexes with TRBP in Immunometabolic regulation and eIF2alpha phosphorylation in obesity. Cell Reports. 11 (2), 295-307 (2015).
- Saito, S. Enhancement of the interferon-induced double-stranded RNA-dependent protein kinase activity by Sindbis virus infection and heat-shock stress. Microbiology and Immunology. 34 (10), 859-870 (1990).
- Youssef, O. A., et al. Potential role for snoRNAs in PKR activation during metabolic stress. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (16), 5023-5028 (2015).
- Murtha-Riel, P., Davies, M. V., Choi, S. Y., Hershey, J. W., Kaufman, R. J. Expression of a Phosphorylation-resistant Eukaryotic Initiation Factor 2 a-Subunit Mitigates Heat Shock Inhibition of Protein Synthesis. The Journal of Biological Chemistry. 268, 12946-12951 (1993).
- Benkirane, M., et al. Oncogenic potential of TAR RNA binding protein TRBP and its regulatory interaction with RNA-dependent protein kinase PKR. The EMBO Journal. 16 (3), 611-624 (1997).
- Koromilas, A., Roy, S., Barber, G., Katze, M., Sonenberg, N. Malignant transformation by a mutant of the IFN-inducible dsRNA-dependent protein kinase. Science. 257 (5077), 1685-1689 (1992).
- Kim, Y., et al. PKR is activated by cellular dsRNAs during mitosis and acts as a mitotic regulator. Genes & Development. 28 (12), 1310-1322 (2014).
- Kim, Y., et al. Deletion of human tarbp2 reveals cellular microRNA targets and cell-cycle function of TRBP. Cell Reports. 9 (3), 1061-1074 (2014).
- Zhu, P. J., et al. Suppression of PKR promotes network excitability and enhanced cognition by interferon-gamma-mediated disinhibition. Cell. 147 (6), 1384-1396 (2011).
- Dagon, Y., et al. Double-stranded RNA-dependent protein kinase, PKR, down-regulates CDC2/cyclin B1 and induces apoptosis in non-transformed but not in v-mos transformed cells. Oncogene. 20 (56), 8045-8056 (2001).
- Elbarbary, R. A., Li, W., Tian, B., Maquat, L. E. STAU1 binding 3′ UTR IRAlus complements nuclear retention to protect cells from PKR-mediated translational shutdown. Genes & Development. 27 (13), 1495-1510 (2013).
- Cho, J., et al. LIN28A is a suppressor of ER-associated translation in embryonic stem cells. Cell. 151 (4), 765-777 (2012).
- Licatalosi, D. D., et al. HITS-CLIP yields genome-wide insights into brain alternative RNA processing. Nature. 456 (7221), 464-469 (2008).
- Van Nostrand, E. L., et al. Robust transcriptome-wide discovery of RNA-binding protein binding sites with enhanced CLIP (eCLIP). Nature Methods. 13 (6), 508-514 (2016).
- Kim, Y., et al. PKR Senses Nuclear and Mitochondrial Signals by Interacting with Endogenous Double-Stranded RNAs. Molecular Cell. 71 (6), 1051-1063 (2018).
- Kim, B., Jeong, K., Kim, V. N. Genome-wide Mapping of DROSHA Cleavage Sites on Primary MicroRNAs and Noncanonical Substrates. Molecular Cell. 66 (2), 258-269 (2017).
- Ricci, E. P., et al. Staufen1 senses overall transcript secondary structure to regulate translation. Nature Structural & Molecular Biology. 21 (1), 26-35 (2014).
- Kim, B., Kim, V. N. fCLIP-seq for transcriptomic footprinting of dsRNA-binding proteins: Lessons from DROSHA. Methods. , (2018).
- Dhir, A., et al. Mitochondrial double-stranded RNA triggers antiviral signalling in humans. Nature. 560 (7717), 238-242 (2018).
