Détermination du taux de fécondation des oeufs de Bemisia tabaci , utilisant une Technique cytogénétique
Summary
Nous présentons une technique cytogénétique simple à l’aide de 4′, 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) pour déterminer le taux de fécondation et sex-ratio primaire du ravageur envahissantes haplodiploïdes Bemisia tabaci.
Abstract
Quelques espèces d’aleurodes suceurs de sève sont des ravageurs plus dommageables terrestres dans le monde entier en raison des dommages causés aux cultures qu’ils infligent et phytovirus qu’ils vector. Malgré de nombreuses études sur la biologie de ces espèces dans des environnements différents, un paramètre de clé cycle biologique, progéniture sex-ratio, a reçu peu d’attention, est encore important pour prédire la dynamique de la population. Le sex-ratio primaire (sex-ratio à la ponte) de Bemisia tabaci , n’a jamais été signalé mais peut être trouvé en déterminant le taux de fécondation des oeufs d’insecte haplodiploïdes. La technique consiste à le dechorionation des oeufs avec l’eau de Javel, une série d’étapes de fixation et l’application de la tache fluorescente générale de l’ADN, DAPI (4 ‘, 6-diamidino-2-phénylindole, un colorant fluorescent de liaison à l’ADN), lier à pronucléus femelles et mâles. Nous présentons ici la technique et un exemple de son application, pour tester si une bactérie endosymbiotique, Rickettsia SP. nr. bellii, influencé le sex-ratio primaire de b. tabaci. Cette méthode peut aider dans l’étude de la population de mouches blanches, ou pour déterminer si l’attribution du sexe existe avec certains stimuli de l’environnement.
Introduction
L’étude de la répartition du sexe, ou l’investissement relatif chez les descendants mâles et femelles, est des pierres angulaires de l’écologie comportementale1,2,3. En plus de sa puissance pour tester des modèles adaptatifs de comportement, connaître la stratégie d’allocation de sexe d’un organisme peut améliorer les modèles de sa dynamique de population. Chez de nombreuses espèces, allocation de sexe est contrôlée par les mères. Pour déterminer l’allocation de sexe, il est important de déterminer le sex-ratio primaire ou la proportion des femelles au moment de la ponte. Bien que le rapport des sexes à l’émergence des adultes peut fournir des indices d’allocation de sexe, la mortalité différentielle développementale entre mâles et femelles juvéniles peut biaiser communément substantiellement le sex-ratio adult. Chez certaines espèces d’hyménoptères, l’ordre des insectes qui contient des fourmis, abeilles et guêpes, le sex-ratio primaire a été déterminé avec des analyses cytogénétiques, souillant les embryons pour afficher génétique ADN. Comme les hyménoptères sont haplodiploïdes, un œuf mâle naissant est haploïde et contient seulement le pronucleus femelle (n), tandis que naissantes œufs femelles sont diploïdes et contenant le pronucléus mâles et femelles (2n). Bien que Aleyrodidae, la famille sap qui se nourrissent des Hémiptères (Hemiptera) appelées mouches blanches, sont également haplodiploïdes, il n’a pas été un dosage établi pour trouver le sex-ratio primaire chez ces insectes. C’est peut-être surprenant étant donné l’intensité de l’étude des parasites graves peu cosmopolites dans cette famille et de l’importance du sex-ratio chez les interactions compétitives des aleurodes4,5,6,7 ,8,9,10 et dans la dynamique de la population en général. Aussi, chez les insectes haplodiploïdes sex-ratio sont sans contrainte par les systèmes de détermination sexuelle, prévoyant la possibilité de fécondation sélective et sex-ratio labile qui varient avec l’ environnement2. Nous présentons ici une technique pour déterminer le sex-ratio primaire du complexe espèces d’aleurodes, connus collectivement comme les aleurodes de patate douce, b. tabaci. Ce nom d’une espèce englobe plus de 28 espèces dans le monde entier11et comprend certains des plus dommageables des ravageurs envahissants global12,13. L’application de cette technique pour déterminer les patrons d’allocation de sexe de b. tabaci et autre Aleyrodidae permettra une enquête plus rigoureuse de variables, telles que température, plante-hôte, des bactéries endosymbiotiques ou plante/aleurodes agents pathogènes, qui peuvent influencer les aleurodes sex-ratio primaire et dynamique de population des aleurodes.
Nous sommes pas au courant de toute technique de coloration à le œuf comparables pour b. tabaci. Le protocole est pratique par rapport aux méthodes de coloration utilisées pour les autres œufs d’insectes14 car il omet une nuit étape de fixation et, par conséquent, peut être complété en 3 h. Comme exemple d’une application, une bactérie endosymbiotique, Rickettsia SP. nr. bellii, est associé de partialité féminine dans nos lignes de laboratoire de b. tabaci Moyen Orient-Asie mineure 1 (MEAM1)15,16. En une seule ligne de laboratoire de MEAM1 de b. tabaci (« MAC1, » prélevés dans le centre agricole de Maricopa), nous testons si Rickettsia-fertilisent les femelles (R+) infectées plus d’oeufs que les femelles infectées (R–).
Protocol
Representative Results
Discussion
Ce protocole est le premier à capturer le taux de fécondation ou sex-ratio primaire de b. tabaci. Le défi du présent protocole, c’est qu’il exige des chercheurs apprendre à gérer les oeufs de la mouche blanche rapidement, veiller à ce que pas plus de 1 h est écoulé depuis que les oeufs ont été pondus jusqu’à ce qu’ils sont fixés. Au cours d’expériences préliminaires, les oeufs qui ont été fixés à 3 h ou plus ponte étaient trop vieux pour observer la fécondation, la Syngamie avait eu …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette recherche a été financée par une subvention de NSF (DEB-1020460) à n235 et une subvention de l’USDA AFRI (2010-03752) à n235 Les auteurs remercient Brennan Zehr pour la coloration des oeufs de la mouche blanche avec beaucoup de compétence et Zen. Les auteurs remercient Mike Riehle permettant l’utilisation de son microscope à fluorescence pour l’imagerie. Les auteurs remercient Suzanne Kelly et Marco Gebiola pour les images de l’oeuf. Les auteurs remercient Suzanne Kelly et Jimmy Conway pour aider à des moments cruciaux au cours des expériences.
Materials
| 1XPBS | Any | ||
| 1XTBST | Any | 5X solution made from 30g Tris, 43.8g NaCl, 5 mL Tween-20 and 1.0g NaN3 pH7.5, and brought to 1L with PCR grade water | |
| Bleach | Clorox | Any household bleach will work as long as it can be diluted to 0.83% Sodium hypochlorite | |
| Clear nail polish | Any | ||
| DAPI dilactate | Santa Cruz Biotechnology | sc300415 | |
| Ethanol | Any | Dilute to 70% EtOH | |
| Fluorescent microscope | Nikon | Nikon Eclipse 50i was used in this experiment, but any fluorescent microscope with 340/380 nm excitation filter and at least 4-10X magnification can be used | |
| Glacial acetic acid | Mallinckrodt | UN2789 | |
| Glycerol | Any | ||
| Microscope | Wild | A Wild M5A microscope was used for this experiment, but any microscope where the operator can clearly see the whitefly eggs can be used | |
| Microscope slide covers | Any | Methods are for 18mm x 18mm sized slide covers. More mounting media will need to be added for larger slide covers. | |
| Microscope slides | Any | ||
| Minuten nadel pins | BioQuip | 1208SA | Minuten nadel pins are optional for fashioning as probes with pipette tips |
| NaCl | Any | ||
| NaN3 | Any | ||
| n-propyl-gallate | Sigma/Santa Cruz Biotechnology | P3130/sc-250794 | |
| Parafilm | Bemis | ||
| Pasteur pipettes | Fisher Scientific | 13-678-20A | Fisherbrand Disposable Borosilicate glass Pasteur pipettes 5.75 in. A Bunsen burner may also be needed if operator would like to lengthen and narrow pipettes |
| PCR grade water | Any | ||
| Pipette tips | Any | Pipette tips are optional for fashioning as probes with minuten nadel pins | |
| Small dropper bulb | Any | Must fit on Pasteur pipette | |
| Tris | Any | ||
| Tween-20 | Any |
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