Isolement des cellules régénératives dérivées adipeuses pour le traitement de la dysfonction érectile après une prostatectomie radicale

Toutes les méthodes décrites dans le protocole ont été approuvées par le Comité national d’éthique danois (n° 37054), l’Autorité danoise de la santé et des médicaments (numéro EUDRA-CT 2013-004220-11) et l’Agence danoise de protection des données (2008-58-0035). L’étude a été enregistrée à ClinicalTrials.gov (NCT02240823). L’étude a été réalisée conformément à la Déclaration d’Helsinki surveillée par l’unité des bonnes pratiques cliniques (BPC) de l’hôpital universitaire d’Odense. La préparation de l’ADRC a été effectuée dans un établissement de tissus agréé pour la manipulation de tissus et de cellules humains à l’hôpital universitaire d’Odense (Autorité danoise de la santé et des médicaments, autorisation n° 29035). 1. Recrutement des patients/participants Pour participer à l’essai, recrutez des patients qui remplissent les critères d’inclusion suivants. Recruter des patients âgés de plus de 18 ans, sexuellement actifs avant la RP et non infectés par les maladies sexuellement transmissibles, par exemple l’infection par le virus de l’immunodéficience humaine, la syphilis ou l’hépatite. Assurez-vous qu’ils souffrent de dysfonction érectile après une RP qui a été effectuée en raison d’un cancer de la prostate.REMARQUE: Dans cette étude, les patients ont été inclus dans l’étude 5 à 18 mois après la RP et ont été inclus quelle que soit la méthode chirurgicale: ouvert / assisté par robot ou nettoyage nerveux / non nerveux. S’assurer que la valeur de l’antigène prostatique spécifique (APS) devait être indétectable lors du suivi clinique après la RP. Assurez-vous que les patients étaient sexuellement actifs avant la RP et qu’ils exprimaient toujours le souhait de rester sexuellement actifs après la RP. S’assurer qu’une intervention pharmacologique avec un inhibiteur de la phosphodiestérase de type 5 (inhibiteur de la PDE5 ) ou un analogue synthétique de la prostaglandine E1 (PGE1) a été essayée avant de participer et jugée insuffisante. De plus, assurez-vous que les patients ont suffisamment de graisse sous-cutanée sur l’abdomen ou la cuisse. Exclure les patients de l’essai, s’il y a eu des événements graves sous anesthésie pendant la RP ou s’ils ont été traités avec des anticoagulants. 2. Liposuccion REMARQUE: La liposuccion est une opération qui élimine la graisse ou les lipocytes de la région sous-cutanée. Cette partie du protocole est réalisée en tant que liposuccion standard et la procédure est effectuée dans des conditions stériles dans une salle d’opération. Tous les instruments utilisés dans le cadre de la procédure doivent être stériles et le chirurgien doit porter des gommages, une blouse chirurgicale stérile, des gants stériles, un masque chirurgical et un chapeau. Anesthésier le patient. Assurez-vous que le patient est sous anesthésie générale pendant la procédure et que cette partie est effectuée par un anesthésiste. Désinfecter la peau de l’abdomen et du scrotum avec de la chlorhexidine à 0,5 % (alcool de clorhexidine, digluconate de chlorhexidine médicamenteux à 96 % à l’éthanol 77 % W/W = 83 % v/v). Utilisez un marqueur chirurgical pour dessiner les zones de l’abdomen où la liposuccion va être effectuée. La zone sera généralement la zone entre la symphyse et l’ombilic. Faites deux incisions de 6 mm de large dans la peau de l’abdomen avec un scalpel (numéro 11). Placez les incisions symétriquement et latéralement à partir de la zone de liposuccion vers le haut. Mettez un peu de lubrifiant tel que de la vaseline sur les incisions, pour vous assurer que la canule d’infiltration glisse facilement dans et hors des incisions pendant la liposuccion. Introduisez une canule d’infiltration de taille 14 G à travers les incisions de la peau. Injecter la solution de Kleins modifiée par voie sous-cutanée dans les zones marquées parallèles à la surface de la peau. Injectez une telle quantité de la solution que le tissu ciblé devient enflé et ferme, ou tumescent.REMARQUE: La solution de Kleins modifiée se compose d’une solution de 1 000 mL de lactate de Ringers et de 1 mg d’adrénaline (épinéphrine (1:1 000 000)). Ne pas faire d’anesthésie locale à la solution, car cela pourrait avoir un impact négatif sur les ADRC. Injecter un volume de solution de Kleins modifiée qui correspond au rapport 1:1 au tissu adipeux. Attendez 10 minutes pour maximiser l’effet de l’adrénaline et réduire la quantité de sang dans le tissu adipeux récolté. Effectuer une liposuccion standard à l’aide d’une liposuccion par perfusion à jet pour prélever 200 à 300 mL de tissu adipeux. Utilisez des canules émoussées creuses, auxquelles un tube de perfusion et une buse sont intégrés. Fixez la canule à un dispositif d’aspiration pour la liposuccion.REMARQUE: Une infusion d’eau continue en forme d’éventail desserre le tissu adipeux en fragments qui peuvent être facilement aspirés par l’ouverture de la canule. Introduire une seringue de 3 mm avec une pointe émoussée à travers les incisions sur l’abdomen Recueillir le tissu adipeux dans un lipo-collecteur pour préserver le lipoaspirat dans un environnement stérile. La lipoaspirat commencera à se séparer de la phase aqueuse. Utilisez des seringues stériles de 50 mL pour aspirer le lipoaspirat du lipo-collecteur. Minimisez le volume d’eau aspiré dans les seringues et vissez un bouchon sur l’extrémité des seringues pour garder le tissu adipeux stérile. Placez les seringues avec la pointe vers le bas dans un sac en plastique stérile pour commencer la séparation de la lipoaspirat de la phase aqueuse. Placez le sac dans un récipient stérile encore avec les extrémités orientées vers le bas pour continuer la séparation. Couvrez le conteneur avec un drap stérile pour sécuriser l’environnement stérile pendant le transport.REMARQUE: Selon le manuel d’utilisation de la machine utilisée pour l’isolation, le lipoaspirat peut être stocké jusqu’à un maximum de 4 heures avant l’isolement des ADRC, cependant, nous le traitons toujours immédiatement. Fermez les incisions cutanées avec le matériau de suture préféré des chirurgiens. Placez un vêtement de compression, un liant abdominal, autour de l’abdomen pour réduire l’œdème postopératoire. Faire un bloc pénien en injectant 20 mL de bupivacaïne 5 mg/mL contenant 5 μg d’adrénaline. Utilisez une seringue de 20 mL et appliquez avec une aiguille de 23 G, de 1 1/4 pouce de long. Appliquer 5 mL de bupivacaïne dans chaque quadrant de la sous-cutis. Injecter la bupivacaïne à deux sites, l’un placé ventralement et l’autre dorsalement. Introduire l’aiguille sur toute sa longueur dans le tissu sous-cutané en pointant l’aiguille latéralement vers la droite et injecter l’anesthésie au fur et à mesure que l’aiguille est rétractée. Répétez l’injection en pointant l’aiguille vers la gauche.REMARQUE: Le patient peut maintenant être réveillé de l’anesthésie générale par l’anesthésiste. 3. Isolement des ADRC REMARQUE: Le processus d’isolement des ADRC est effectué comme décrit en détail dans le manuel d’utilisation suivant l’appareil (voir le tableau des matériaux). Il est important que la procédure soit effectuée dans des conditions stériles pour s’assurer que la lipoaspirat n’est exposée à aucun contaminant lors de la purification des ADRC. Le temps nécessaire à l’isolement des ADRC dépend du volume de lipoaspirat, mais l’ensemble de la procédure prendra environ 2,5 heures à l’aide du dispositif semi-automatique décrit ici. Placez tous les consommables et enzymes de manière aseptique sur une table recouverte d’une serviette chirurgicale jetable stérile.REMARQUE: Un kit de procédure contient tous les consommables et enzymes nécessaires à l’isolement des ADRC d’un patient. En outre, trois poches de perfusion d’un litre de Ringers lactées de 37 à 39 ° C doivent être disponibles avec des vêtements stériles, des gants et des serviettes et de l’éthanol pour la désinfection. Notez tous les nombres de lots de consommables et d’enzymes ainsi que la température des sonneurs lactés, lorsqu’ils sont connectés au système. Essuyez l’appareil avec de l’éthanol et suivez les instructions du fabricant Chargez l’ensemble consommable sur l’appareil et connectez un sac de sonneries lactées au système. Effectuez la série de tests semi-automatiques (vérification du système et test d’étanchéité) avant d’ajouter le lipoaspirat. Laissez le lipoaspirate reposer dans des tubes de 50 mL pendant que les étapes en 3.1 sont effectuées. Cela permettra à la graisse de se séparer de la phase liquide. Notez la quantité totale (en mL) de tissu adipeux et utilisez-la pour vous assurer que la quantité de graisse chargée sera dans la plage de la capacité de l’appareil. Chargez le tissu lorsque l’appareil vous y invite. La machine va maintenant drainer l’excès de liquide et peser la quantité de tissu adipeux chargée avant qu’elle ne soit lavée avec des sonneurs lactés. Lorsque le tissu a été lavé et égoutté à nouveau, connectez une nouvelle poche de perfusion avec des sonneurs lactés à 37-39 °C à la demande de la machine. Reconstituer l’enzyme disponible dans le commerce contenant du mélange de collagénase et de protéase dans 5 mL de Ringers lactés (un flacon d’enzyme suffit pour des quantités de graisse allant jusqu’à 270 mL). Assurez-vous que l’appareil affiche la quantité d’enzyme (en fonction du poids du tissu) à injecter dans le bidon avec le tissu adipeux. Une fois injecté, la digestion enzymatique qui est effectuée sous agitation durera environ 20 min. Après la digestion des tissus, laissez l’agitateur s’arrêter et vérifiez que le contenu est séparé en deux phases: une phase jaune contenant des lipides supérieurs et une couche rose inférieure contenant les ADRC. Laissez cette dernière couche s’écouler dans la chambre de traitement cellulaire (qui va dans la centrifugeuse intégrée de l’appareil) de l’ensemble consommable, tout en laissant la couche lipidique derrière. Laissez les ADRC se concentrer dans la chambre de traitement cellulaire pendant plusieurs cycles de centrifugation. Ajoutez maintenant 10 mL d’Intravase (contient de la DNase, qui permet d’éviter l’agglutination dans la suspension adrc finale) reconstituée dans des sonneurs lactés. La réaction enzymatique dure 10 min après quoi les ADRC sont lavés.REMARQUE: Cette étape est entièrement automatique et la machine vous informera lorsque le processus est terminé. Lorsque l’isolement des ADRC est terminé, remettez en suspension les cellules dans 5 mL de lactate de Ringer. Aspirer la solution dans une seringue de 5 mL. Montez un verrou Luer femelle à 3 voies sur la seringue de 5 mL contenant les ADRC et aspirez 4 mL d’ADRC dans une autre seringue stérile de 5 mL. Transférer les 1 derniers mL dans une seringue de 1 mL. Utilisez ce 1 mL pour la caractérisation des ADRC, par exemple, le nombre de cellules, la viabilité cellulaire, l’analyse des marqueurs de surface par cytométrie en flux et la capacité de différenciation adrc. Mettez une aiguille de 25 G sur la seringue de 5 mL contenant les 4 mL d’ADRC avant qu’elle ne soit emballée dans un drap stérile. Utilisez les ADRC pour injection dans le receveur. Dans ce cas, la solution d’ADRC contiendra en moyenne 8,4 à 32,7 millions de cellules. 4. Implantation des ADRC dans les corps caverneux REMARQUE: Il s’agit d’une procédure stérile. Tous les instruments doivent être stériles et la personne qui injecte la solution contenant les cellules souches dans les corps caverneux doit porter des gants stériles. Le patient est éveillé pendant cette procédure et recevra ses propres cellules souches. Les ADRC sont injectés sans compter les cellules avant l’injection. Gardez la solution d’ADRC homogène en inclinant doucement la seringue jusqu’à ce qu’elle soit injectée dans les corps caverneux. Placez un drapé d’ouverture sur le pénis. Placez un garrot à la racine du pénis en utilisant une boucle de vaisseau en silicone. Serrez la boucle et fixez-la avec des pinces incurvées pean. Faites le garrot assez serré pour arrêter le flux sanguin du pénis. Utilisez deux échanges antiseptiques pour désinfecter la peau du pénis au site d’injection (site latéral des corps caverneux). Injecter 1 mL de la solution contenant des ADRC, dans un angle direct dans les corps caverneux du côté droit à deux endroits différents, répéter cette étape ensuite dans le corps caverneux gauche. Le volume total des ADRC injectés est de 4 mL. Attendez 30 min, puis retirez le garrot. Libérer le patient après 2 h d’observation après l’injection d’ADRC, pour s’assurer que le patient est bien rétabli après l’anesthésie. 5. Soins postopératoires Recommandez au patient de ne pas faire de performance physique qui peut augmenter la pression artérielle au cours de la première semaine, pour prévenir le développement d’hématomes. Recommandez au patient de porter le liant abdominal pendant 24 heures les 14 premiers jours après la chirurgie et ensuite pendant 14 jours pendant la journée. Traiter la douleur postchirurgicale avec de l’acétaminophène par voie orale (p. ex., paracétamol; 1 000 mg, 4 fois par jour) et des anti-inflammatoires oraux (p. ex. ibuprofène; 400 mg 3 fois par jour).