여기 선물이 분석 Aspergillus flavus 성장과 아플 라 톡 신 생산 옥수수 커널에서 항진균 단백질을 표현 하는 프로토콜. 우리는 감염 및 실시간으로 성숙한 커널에 곰 팡이의 확산을 모니터링 GFP 표현 A. flavus 긴장을 사용 하 여. 분석 결과 신속 하 고 신뢰할 수 있는, 재현.
아플 라 톡 신 오염 식품 및 사료 작물은 전세계 주요 도전 이다. Aflatoxins, Aspergillus flavus (A. flavus) 균에 의해 생산은 실질적으로 옥수수와 인간과 동물 건강에 심각한 위협이 포즈 외 땅콩 같은 다른 기름 풍부한 작물 자르기 값을 줄일 수 있는 강력한 발암 물질. 전통적인 번 식, 저항 관련 된 단백질과 RNA 간섭 (RNAi)의 유전자 변형 식을 포함 하 여 다른 접근-호스트 유도 유전자 침묵의 중요 한 A. flavus 기반 유전자 대상, 평가 되 고 증가 하 아플 라 톡 신 취약 작물에 저항입니다. 과거 연구 A. flavus pathogenesis 및 아플 라 톡 신 생산,이 유전자/효소 제안에 α-아 밀라 아 제의 중요 한 역할은 A. flavus 성장과 아플 라 톡 신 생산을 줄이기 위해 잠재적인 대상으로 나타났습니다. 이와 관련, 현재 연구 A. flavus에 대 한 옥수수에 Lablab purpureus L. α-아 밀라 아 제 억제제와 같은 단백질 (AILP)의 (제정 CaMV 35S 발기인 통제) 분리 식 평가에 착수 했다. AILP A. flavus α-아 밀라 제 효소의 경쟁적 억제제 이며 콩 공통 lectin-arcelin-α-아 밀라 아 제 억제 물 단백질 가족에 속하는 36 kDa 단백질 이다. 현재 작업 전에 생체 외에서 연구 A. flavus α-아 밀라 제 활동 및 곰 팡이 성장 억제에 AILP의 역할을 시연 했다. 곰 팡이 성장 및 성숙한 커널에서 아플 라 톡 신 생산 GFP 표현 A. flavus 긴장을 사용 하 여 실시간으로에서 감시 되었다. 이 커널 분석 (KSA) 상영은 매우 간단 합니다을 설정 하 고 germplasm 및 유전자 변형 라인의 평가 대 한 감염 및 측정할 수 있는 확산의 범위에 안정적이 고 재현 가능한 데이터를 제공 합니다. GFP 긴장에서 형광 곰 팡이를 밀접 하 게 연관 된 성장 이며, 확장 하 여, 그것은 아플 라 톡 신 값을 잘 상관. 현재 작업의 목표는 아플 라 톡 신 저항을 증가 하는 옥수수 처럼 상업적으로 중요 한 작물에서이 이전 지식을 구현 했다. 우리의 결과 표현 하는 AILP 유전자 변형 옥수수 알갱이, 차례 차례로, 아플 라 톡 신 레벨 62%-88% 감소에 번역에 A. flavus 성장에 35%-72% 감소를 보여 줍니다.
Aspergillus, 강했다 Fusarium, 푸른 곰 팡이, 곰 팡이 속으로 mycotoxin 오염 식품의 중요 한 문제 이며, 사료 작물 재배 전세계1,2,3. 이러한 phytopathogenic 버섯 중 Aspergillus 자르기 값과 인간과 동물 건강에 가장 불리 한 충격이 있다. Aspergillus flavus (A. flavus)은 옥수수, 면 실 등 땅콩 기름 풍부한 작물을 감염 하 고 수많은 독성 2 차 대사 산물 (SMs) 뿐만 아니라 강력한 발암 물질, aflatoxins, 생성 한 기회주의적 식물 병원 체 이다. 옥수수는 중요 한 음식 및 전세계 재배 작물을 먹이 이며 A. flavus에의해 오염에 매우 쉽습니다. 아플 라 톡 신 오염에의 경제적 영향을 잃고 및 옥수수에 감소 값으로 686.6 백만 달러/년 미국2 예측 변화 글로벌 기후에, aflatoxins의 영향으로 옥수수에 큰 경제적 손실을 초래할 수 있습니다. 평가 높은 1.68 십억 달러/년 가까운 미래2. 인간과 가축에 aflatoxins의 불리 한 경제 및 건강 효과 감안할 때, 옥수수에 사전 수확 아플 라 톡 신 제어 식품의 아플 라 톡 신 오염 방지 제품을 공급 하는 가장 효율적인 방법을 수 있습니다.
지난 몇 십년에 광범위 하 게 사용 된 옥수수의 아플 라 톡 신 저항에 대 한 주요 사전 수확 제어 접근 시간4의 상당한 금액을 요구 하는 번 식 통해 주로 이다. 최근, biocontrol 대규모 필드 응용 프로그램5,6에서 아플 라 톡 신 감소에서 약간의 성공을 했다. Biocontrol, 게다가 최첨단 분자 도구 ‘ 호스트 유도 유전자 침묵 ‘ RNAi 통해 (HIGS) 등의 응용 프로그램 및 저항 관련 단백질의 유전자 변형 식 몇 가지 성공을 했다 A. flavus 성장과 아플 라 톡 신에의 감소에 작은 규모의 실험실 및 현장 연구에 있는 생산. 이러한 접근은 현재 미래 조작 위한 새로운 잠재적인 A. flavus 유전자 표적 식별 이외에 최적화 되 고 있습니다.
유전자 유전자 변형 제어 전략의 잠재적인 대상으로 mycotoxin 생산에 직접 관련 되는, 게다가 곰 팡이 amylases 성공적인 pathogenesis 및 mycotoxin 생산 초기 단계를 유지 하는 중요 한 역할을 재생 표시 되었습니다. 호스트 공장 감염. 몇 가지 예로 Pythium pleroticum (생강 rhizome 부패의 인과 대리인), Fusarium solani (콜리플라워 윌 트의 인과 대리인), 긍정적인 상관 관계 pathogenicity와 α-아 밀라 제 식 및 활동 사이 를 관찰 했다 7,8. 유전자 녹아웃 또는 최저의 방법을 통해 α-아 밀라 제 활동의 금지는 곰 팡이 성장과 독 소 생산을 부정적인 영향을 줍니다. A. flavus 의 α-아 밀라 제 녹아웃 돌연변이 aflatoxins 전 기판 또는 degermed 옥수수 커널9에 성장 될 때 생산 하지 못했습니다. 마찬가지로, Fusarium verticillioides 에 α-아 밀라 제 녹아웃 스트레인 옥수수 커널10의 감염 시 fumonisin B1 (mycotoxin)을 생산 하지 못했습니다. 더 최근의 연구에서 길버트 외. (2018) 시연 HIGS 통해 A. flavus α-아 밀라 제 식의 아래로 RNAi 기반 노크 크게 감소 옥수수 커널 감염11 시 A. flavus 성장과 아플 라 톡 신 생산 .
또한 α-아 밀라 제 활동의 특정 억제제는 α-아 밀라 제 식의 다운 레 귤 레이 션으로 비슷한 결과 생산 했습니다. 곰 팡이 저항에는 α-아 밀라 아 제 억제제의 역할에 첫 번째 보고서는 분리와 옥수수 라인 저항 A. flavus12에서 14 kDa 트립 신-α-아 밀라 아 제 억제제의 특성에서 왔다. 더 Lablab purpureus L.13, 히 아 신 스 콩의 씨앗에서 Fakhoury 및 Woloshuk 36 kDa α-아 밀라 아 제 억제제와 같은 단백질 (AILP)의 식별에 의해 식물 종의 수백의 상영. Lectin-arcelin-α-아 밀라 아 제 억제 물 가족에 속하는 AILP 닮은 lectins의 펩 티 드 순서 일반적인 콩14,15보고. 순화 AILP 포유류 trypsin 및 A. flavus 성장 및 conidial 발 아13의 중요 한 금지를 보여주었다 생체 외에서 특성 추가 금지 행위를 발생 하지 않습니다. 제시 하는 보고서 여기 명확 하 게 쇼 α-아 밀라 제 역할을 할 수 제한 하는 병원 체 또는 전 분 (α-아 밀라 제 활동)을 통해 동원 및 중 에너지 원으로 녹는 설탕의 수집에 의존 하는 해충을 제어 방식에서 대상 들 호스트 식물 병원 성 상호 작용입니다.
알파-아 밀레이 스 A. flavus pathogenicity9,,1011, 그리고 강력한 안티-A. flavus 에이전트 (α-아 밀라 제 억제/antigrowth)13, AILP의 중요성을 감안할 때 중요 한 것으로 알려져 있다 Lablab AILP 을 표현 하는 유전자 변형 옥수수 식물 생성 제정 CaMV 35S 발기인에서 유전자. 목표는 옥수수에이 α-아 밀라 아 제 억제 물의 분리 표현식이 A. flavus pathogenesis 및 아플 라 톡 신 생산 옥수수 커널 감염에 대 한 효과 조사 했다. 우리의 결과 AILP를 크게 표현 하는 유전자 변형 옥수수 커널 커널 감염 시 A. flavus 성장과 아플 라 톡 신 생산 감소를 보여 줍니다.
병원 균과 해충 농업 작물에서 수확량 손실 글로벌 문제20이다. 현재, 합성 살 균 제와 살충제의 응용 프로그램 제어 식물 병원 균과 해충에 대 한 주된 수단 이지만 이러한 바이오 식품 및 사료의 잔류 독성21인간과 동물 건강 심각한 위협을 제기할 수 있다. 식품 및 사료 작물 옥수수의 경제 중요성, 고려에 감소 또는 아플 라 톡 신 오염 제거 가장 중요<sup class="x…
The authors have nothing to disclose.
우리는 데이비드 Meints, 알칸사 스의 대학 초기 세대 중 유전자 변형 옥수수를 분석에 그의 원조에 대 한 감사 합니다. 이 작품 미국 농 무부-ARS 크리스틴 프로젝트 6054-42000-025-00D의 재정 지원을 받았다. 상호 또는이 문서에서 상용 제품의 언급만을 목적으로 특정 정보를 제공 하 고 미국 농 무부에 의해 승인 또는 추천을 의미 하지는 않습니다. 미국 농 무부-ARS의 동등한 고용 기회 (EEO) 정책 모든 사람을 위한 기회 균등을 명령 하 고 기관의 인사 정책, 관행 및 작업의 모든 측면에서 차별 금지.
Agar | Caisson | ||
Amazing Marine Goop | Eclectic Products | ||
C1000 Touch CFX96 Real-Time System | Bio-Rad | ||
Corning Falcon Tissue Culture Dishes, 60 mm | Fisher Scientific | 08-772F | |
Eppendorf 5424 Microcentrifuge | Fisher Scientific | ||
Erlenmeyer flask with stopper, 50 mL | Ace Glass | 6999-10 | |
Ethanol | |||
FluoroQuant Afla | Romer Labs | COKFA1010 | |
Fluted Qualitative Filter Paper Circles, 15 cm | Fisher Scientific | 09-790-14E | |
Force Air Oven | VWR | ||
FQ-Reader | Romer Labs | EQFFM3010 | |
Geno/Grinder 2010 | OPS Diagnostics | SP 2010-115 | |
Innova 44 Incubator Shaker | Brunswick Scientific | ||
iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 1708890 | |
liquid Nitrogen | |||
Low Form Griffin Beakers, 100 mL | DKW Life Sciences | 14000-100 | |
Methanol | |||
Methylene Chloride | |||
Nexttec 1-step DNA Isolation Kit for Plants | Nexttec | 47N | |
Nikon Eclipse E600 microscope with Nikon DS-Qi1 camera | Nikon | ||
Nikon SMZ25 stereomicroscope with C-HGFI Episcopic Illuminator and Andor Zyla 4.2 sCMOS camera | Nikon | ||
Nunc Square BioAssay Dishes | ThermoFisher Scientific | 240835 | |
Phire Plant Direct PCR Kit | ThermoFisher Scientific | F130WH | |
Polycarbonate Vials, 15 ml | OPS Diagnostics | PCRV 15-100-23 | |
Potato Dextrose Broth | |||
Snap Cap, 22 mm | DKW Life Sciences | 242612 | |
Sodium Phosphate dibasic heptahydrate | Sigma-Aldrich | ||
Sodium Phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | ||
Spectrum Plant Total RNA Kit | Sigma-Aldrich | STRN50 | |
Stainless Steel Grinding Balls, 3/8'' | OPS Diagnostics | GBSS 375-1000-02 | |
Stir Plate | |||
Synergy 4 Fluorometer | Biotek | ||
T100 Thermal Cycler | Bio-Rad | ||
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T-9284 | |
V8 juice | Campbell's | ||
Whatman Qualitative Grade Plain Sheets, Grade 3 | Fisher Scientific | 09-820P | |
Wrist-Action Shaker | Burrell Scientific |