JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
神经科学

Birden fazla Motor yolları sıçan Spinal Kord Lentiviral bir vektör direkt enjeksiyon vurgulamaktadır

Published: March 15, 2019
doi:
10.3791/59160
, , , ,
1Shriner’s Pediatric Research Center,Temple University

Summary

Bu iletişim kuralı retrogradely taşınabilir bir viral vektör enjeksiyon sıçan spinal kord doku içine gösterir. Vektör sinaps kapladığı ve hedef nöron hücre gövdesi nakletti. Bu model önemli spinal yolları veya gen terapisi uygulamaları için hedefleme hücrelerin retrograd izleme için uygundur.

Abstract

Sinir sisteminde hücreye proteinler ilgi tanıtan en molekülleri erişimi sınırlamak doğuştan gelen biyolojik engelleri nedeniyle zordur. Spinal kord doku içine doğrudan enjeksiyon hücre organları erişim sağlayan bu engelleri atlar veya nerede molekülleri dahil olmak synapses. Bu yöntemle viral vektör teknoloji birleştiren gen terapisi veya yolu izleme amacıyla sinir dokusu içine hedef genlerin giriş için izin verir. Burada son derece etkili retrograd taşıma (HiRet) için tasarlanmış bir virüs, propriospinal interneurons (PNs omurilik ve beyin sapı çekirdeği nöronlarda için özel taşıma teşvik etmek) sinapslarda geliştirdiler. PNs hedefleme, rubrospinal ve reticulospinal yolları yanı sıra birbirleri ile onların arabağlantı omurilik segmentler boyunca gibi motor yolları üzerinden aldıkları çok sayıda bağlantıları yararlanır. Temsilcisi izleme hücre gövdeleri, akson ve dendritik arbors Torasik PNs ve reticulospinal nöronlarda pontine ağsı yapısal etkin yeşil flüoresan protein (GFP) gösterir yüksek sadakat ayrıntılarını HiRet vektör kullanarak. HiRet birleştirmek de beyin sapı yolları ve PNs ama yaş bağımlı entegrasyon corticospinal yolu nöronların içine gösterir. Özetle, spinal kord enjeksiyon viral vektörler kullanarak ilgi proteinlerin giriş neurons in hedeflenen arazi içine için uygun bir yöntemdir.

Introduction

Viral vektörler genetik materyal arızalı genler, upregulate önemli büyüme proteinler telafi etmek veya yapısı ve sinaptik bağlantıları vurgulamak marker protein üretimi için hücrelere tanıtabilirsiniz önemli biyolojik araçlardır hedefleri. Bu makale floresan izleme büyük motorlu yolları vurgulamak için yüksek verimli retrogradely taşınabilir lentiviral vektör sıçan spinal kord içine direkt enjeksiyon üzerinde duruluyor.  Bu yöntem da nöronların farklı nüfus proteinler ilgi tanıtmak aksonal rejenerasyon ve büyütme çalışmaları için son derece uygun ve nöronlar fonksiyonel Haritalama çalışmaları1,2için susturmak için kullandı.

Birçok omurilik motor yolları anatomik ayrıntılarını direkt enjeksiyon çalışmalar ile BDA ve fluoro-altın3,4,5,6,7 gibi klasik tarayıcıları aracılığıyla aydınlatılmamıştır , 8. bu tarayıcıları altın standart olarak kabul edilir ancak bazı dezavantajları alımı gibi tarafından hasarlı aksonlar olabilir veya bir enjeksiyon çevreleyen beyaz madde pasajda akson sitesindeki9,10,11 . Bu yolu bağlantısı yanlış yorumlara neden olabilir ve bir dezavantajı ise yenilenme çalışmaları nerede boya absorpsiyonu ile bozuk veya kesik aksonlar lifleri daha sonra analiz12sırasında yeniden oluşturulması için yanlış olabilir olabilir.

Lentiviral vektörel çizimler nöron popülasyonları13,14,15,16,17,18 istikrarlı, uzun vadeli ifadede sağladıkları gen terapisi çalışmalarda, popüler şunlardır ,19. Ancak, geleneksel olarak paketlenmiş lentiviral vektörler retrograd taşıma sınırlı olan ve kullanıldığında bağışıklık sistemi yanıt tetikleyebilir vivo içinde4,20,21. HiRet olarak adlandırdığı bir yüksek verimli retrograd ulaşım vektör retrograd taşıma22,23geliştirir bir melez vektör oluşturmak için bir kuduz virüsü glikoprotein olan viral zarf değiştirerek Kato vd tarafından hazırlanmıştır.

Retrograd izleme o hücrenin axon tarafından alınan ve hücre vücut nakli izin bir hedef nöron sinaptik uzaya bir vektör tanıtır. Başarılı taşıma HiRet nöronal sinapslarda fareler ve maymunlar23,24 beyinlerinin içine ve motor nöronlar22kasına göstermiştir. Bu iletişim kuralı lomber spinal kord, özellikle propriospinal interneurons ve beyin sapı neurons sinaptik terminallerinin hedef içine enjeksiyon gösterir. PNs bağlantıları birçok farklı spinal yolları almak ve böylece omurilik ve beyin sapı nöronlarda farklı bir nüfusa hedeflemek için yararlı olabilir. Bu çalışmada etiketli nöronlar hindlimb motor işlevleri ile ilgili motor nöron havuzları innerve devreleri temsil eder. Sağlam etiketleme omurilik ve beyin sapı, dendritik arbors ve akson terminalleri yüksek sadakat ayrıntılarını dahil görülür. Biz de bu yöntem servikal spinal kord içinde önceki çalışmalarda propriospinal ve beyin sapı reticulospinal yolları25etiketlemek için kullandık.

Bu iletişim kuralı bir viral vektör enjeksiyon lomber spinal kord sıçan içine gösterir. Film 1 ‘ de görüldüğü gibi son kaburga bulunan L1 vertebra tanımlayarak belgili tanımlık kesme hedeflenmektedir. Bu kas L1-L4 omurilik üzerinde ortaya çıkaran bir 3-4 cm kesi Kaudal bir dönüm noktası kullanılır. Laminectomies T11-T13 vertebra dorsal yönlerini gerçekleştirilir ve eğimli cam iğne 0.8 mm lateral orta hat ve alçaltılmış 1.5 mm yönlendirilir virüs enjekte etmek için gri madde içine.

Protocol

Aşağıdaki cerrahi ve hayvan bakımı yordamların tümünü hayvan bakım ve kullanım Komitesi Temple Üniversitesi tarafından onaylanmıştır. 1. cerrahi öncesi hazırlıklar Çekti cam iğneler viral enjeksiyon 3,5 nanoliter cam kapiller Pipetler nanoliter enjektörler için tasarlanmış kullanarak ameliyattan önce bir kaç gün için hazır olun. Bir iki adım iğne çektirmenin iki iğne şablonları oluşturmak için üreticinin yönergelerine uygun olarak her pipet çe…

Representative Results

Başarılı enjeksiyon ve viral vektör taşımacılığının iletim tek taraflı nöronların spinal kord ve bazı beyin sapı çekirdek güçlü bir nüfusun sonuçlanmalıdır. Basmakalıp neurons ve akson torasik spinal kord ve beyin sapı, dört hafta sonrası enjeksiyon pontine ağsı etiketlerine göre şekil 1 gösterir. Önemli GFP ifade torasik spinal kord enjeksiyon (şekil 1A, kutulu alan) Ipsilateral tarafında gri madde nöronlarda görülm…

Discussion

Beyin ve omurilik nöronlarda genetik manipülasyon vurgulamak duyusal, motor ve otonomik yolları floresan izleme aracılığıyla ve büyütme potansiyeli nöronal yollarini yaralanma27,28sonra, keşfetmek için hizmet vermiştir 29 , 30 , 31 , 32 , 33. retrogradely taşınabilir bir viral…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu eser sinir hastalıkları Ulusal Enstitüsü ve kontur R01 R01NS103481 hibe tarafından finanse edildi ve Shriners Hastanesi Pediatrik araştırma hibe SHC 84051 ve SHC 86000 ve Savunma Bakanlığı (SC140089).

Materials

#10 Scalpel Blades Roboz RS-9801-10 For use with the scalpel.
1 mL Syringes Becton, Dickinson and Company 309659 For anesthetic IP injection, potential anesthetic booster shots, and antibiotic injections.
10mL Syringes Becton, Dickinson and Company 309604 For injecting saline into the animal, post-surgery.
4.0 Chromic Catgut Suture DemeTECH NN374-16 To re-bind muscle during closing.
48000 Micropipette Beveler World Precision Instruments 32416 Used to bevel the tips of the pulled glass capillary tubes to form functional glass needles.
5% Iodine Solution Purdue Products L.P. L01020-08 For use in sterilzation of the surgical site.
70% Ethanol N/A N/A For sterilization of newly prepared glass needles, animal models during surgical preparation, and surgeon's hands during surgery, as well as all other minor maintainances of sterility.
Anesthetic (Ketamine/Xylazine Solution) Zoetis 240048 For keeping the animal in the correct plane of consciousness during surgery.
Antibiotic (Cefazolin) West-Ward Pharmaceuticals NPC 0143-9924-90 To be injected subcutaneously to prevent infection post-surgery.
Bead Sterilizer CellPoint 5-1450 To heat sterilize surgical instruments.
Bonewax Fine Science Tools 19009-00 To seal up bone in the case of bone bleeding.
Cauterizer Fine Science Tools 18010-00 To seal any arteries or veins severed during surgery to prevent excessive blood loss.
Digital Scale Okaus REV.005 For weighing the animal during surgical preparation.
Flexible Needle Attachment World Precision Instruments MF34G-5 For cleaning glass needles and loading red oil into glass needles.
Gelfoam Pfizer H68079 To seal up bone in the case of bone bleeding.
Glass Capillary Tubes World Precision Instruments 4878 For pulled glass needles – should be designed for nanoliter injectors.
Hair Clippers Oster 111038-060-000 For clearing the surgical site of hair.
Hemostats Roboz RS-7231 For general use in surgery.
Kimwipes Kimtech 34155 For general use in surgery.
Medium Point Curved Forceps Roboz RS-5136 For general use in surgery.
Micromanipulator with a Vernier Scale Kanetec N/A For precise targeting during surgery.
Microscissors Roboz RS-5621 For cutting glass whisps off of freshly pulled glass capillary tubes.
Microscope with Light and Vernier Scale Ocular Leitz Wetzlar N/A Used to visualize and measure beveling of pulled glass capillary tubes into functional glass needles.
MicroSyringe Pump Controller World Precision Instruments 62403 To control the rate of injection.
Nanoliter 2000 Pump Head Injector World Precision Instruments 500150 To load and inject virus in a controlled fashion.
Needle Puller Narishige PC-100 To heat and pull apart glass capillary tubes to form glass needles.
Ophthalamic Ointment Dechra Veterinary Products RAC 0119 To protect the animal's eyes during surgery.
Parafilm Bemis PM-996 To assist with loading virus into the nanoinjector.
PrecisionGlide Needles (25G x 5/8) Becton, Dickinson and Company 305122 For use with the 1mL and 10 mL syringes to allow injection of the animal model.
Rat Tooth Forceps Roboz RS-5152 For griping spinous processes.
Red Oil N/A N/A To provide a front for visualization of virus entering tissue during injection.
Retractors Roboz RS-6510 To hold open the surgical wound.
Rimadyl Tablets Bio Serv MP275-050 For pain management post-surgery.
Rongeurs Roboz RS-8300 To remove muscle from the spinal column during surgery.
Scalpel Blade Handle Roboz RS-9843 To slice open skin and fat pad of animal model during surgery.
Scissors Roboz RS-5980 For general use in surgery.
Stainless Steal Wound Clips CellPoint 201-1000 To bind the skin of the surgical wound during closing.
Staple Removing Forceps Kent Scientific INS750347 To remove the staples, should they be applied incorrectly.
Sterile Cloth Phenix Research Products BP-989 To provide a sterile surface for the operation.
Sterile Cotton-Tipped Applicators Puritan 806-WC To soak up blood in the surgical wound while maintaining sterility.
Sterile Gauze Covidien 2146 To clean the surgical area and surgical tools while maintaining sterility.
Sterile Saline Baxter Healthcare Corporation 281324 For use in blood clearing, and for replacing fluids post-surgery.
Surgical Gloves N/A N/A For use by the surgeon to maintain sterile field during surgery.
Surgical Heating Pad N/A N/A For maintaining the body temperature of the animal model during surgery.
Surgical Microscope N/A N/A For enhanced visualization of the surgical wound.
Surgical Stapler Kent Scientific INS750546 To apply the staples.
T/Pump Heat Therapy Water Pump Gaymar TP500C To pump warm water into the water convection warming pad.
Water Convection Warming Pad Baxter Healthcare Corporation L1K018 For use in the post-operational recovery area to maintain the body temperature of the unconscious animal.
Weighted Hooks N/A N/A To hold open the surgical wound.
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wang, X., et al. Deconstruction of corticospinal circuits for goal-directed motor skills. Cell. 171 (2), 440-455 (2017).
  2. Kinoshita, M., et al. Genetic dissection of the circuit for hand dexterity in primates. Nature. 487 (7406), 235-238 (2012).
  3. Brichta, A. M., Grant, G. Cytoarchitectural organization of the spinal cord. The rat nervous system. Vol. 2, hindbrain and spinal cord. , (1985).
  4. Liang, H., Paxinos, G., Watson, C. Projections from the brain to the spinal cord in the mouse. Brain Structure & Function. 215 (3-4), 159-186 (2011).
  5. Rexed, B. The cytoarchitectonic organization of the spinal cord in the cat. The Journal of Comparative Neurology. 96 (3), 414-495 (1952).
  6. Schmued, L. C., Fallon, J. H. Fluoro-gold: A new fluorescent retrograde axonal tracer with numerous unique properties. Brain Research. 377 (1), 147-154 (1986).
  7. Veenman, C. L., Reiner, A., Honig, M. G. Biotinylated dextran amine as an anterograde tracer for single- and double-labeling studies. Journal of Neuroscience Methods. 41 (3), 239-254 (1992).
  8. Watson, C., Paxinos, G., Kayalioglu, G., Heise, C. Atlas of the rat spinal cord. The spinal cord. , 238-306 (2009).
  9. Brandt, H. M., Apkarian, A. V. Biotin-dextran: A sensitive anterograde tracer for neuroanatomic studies in rat and monkey. Journal of Neuroscience Methods. 45 (1-2), 35-40 (1992).
  10. Geed, S., van Kan, P. L. E. Grasp-based functional coupling between reach- and grasp-related components of forelimb muscle activity. Journal of Motor Behavior. 49 (3), 312-328 (2017).
  11. Reiner, A., Veenman, C. L., Medina, L., Jiao, Y., Del Mar, N., Honig, M. G. Pathway tracing using biotinylated dextran amines. Journal of Neuroscience Methods. 103 (1), 23-37 (2000).
  12. Steward, O., Zheng, B., Banos, K., Yee, K. M., et al. Response to: Kim et al., "axon regeneration in young adult mice lacking nogo-A/B." neuron 38, 187-199. Neuron. 54 (2), 191-195 (2007).
  13. Brown, B. D., et al. A microRNA-regulated lentiviral vector mediates stable correction of hemophilia B mice. Blood. 110 (13), 4144-4152 (2007).
  14. Lo Bianco, C., et al. Lentiviral vector delivery of parkin prevents dopaminergic degeneration in an alpha-synuclein rat model of parkinson’s disease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (50), 17510-17515 (2004).
  15. Malik, P., Arumugam, P. I., Yee, J. K., Puthenveetil, G. Successful correction of the human cooley’s anemia beta-thalassemia major phenotype using a lentiviral vector flanked by the chicken hypersensitive site 4 chromatin insulator. Annals of the New York Academy of Sciences. 1054, 238-249 (2005).
  16. Pawliuk, R., et al. Correction of sickle cell disease in transgenic mouse models by gene therapy. Science. 294 (5550), 2368-2371 (2001).
  17. Wang, G., et al. Feline immunodeficiency virus vectors persistently transduce nondividing airway epithelia and correct the cystic fibrosis defect. The Journal of Clinical Investigation. 104 (11), R55-R62 (1999).
  18. Liang, H., Paxinos, G., Watson, C. The red nucleus and the rubrospinal projection in the mouse. Brain Structure & Function. 217 (2), 221-232 (2012).
  19. Abdellatif, A. A., et al. delivery to the spinal cord: comparison between lentiviral, adenoviral, and retroviral vector delivery systems. Journal of Neuroscience Research. 84 (3), 553-567 (2010).
  20. DePolo, N. J., et al. VSV-G pseudotyped lentiviral vector particles produced in human cells are inactivated by human serum. Molecular Therapy. 2 (3), 218-222 (2000).
  21. Higashikawa, F., Chang, L. Kinetic analyses of stability of simple and complex retroviral vectors. Virology. 280 (1), 124-131 (2001).
  22. Hirano, M., Kato, S., Kobayashi, K., Okada, T., Yaginuma, H., Kobayashi, K. Highly efficient retrograde gene transfer into motor neurons by a lentiviral vector pseudotyped with fusion glycoprotein. PLoS One. 8 (9), e75896 (2013).
  23. Kato, S., et al. A lentiviral strategy for highly efficient retrograde gene transfer by pseudotyping with fusion envelope glycoprotein. Human Gene Therapy. 22 (2), 197-206 (2011).
  24. Kato, S., et al. Selective neural pathway targeting reveals key roles of thalamostriatal projection in the control of visual discrimination. The Journal of Neuroscience. 31 (47), 17169-17179 (2011).
  25. Sheikh, I. S., Keefe, K. M., et al. Retrogradely transportable lentivirus tracers for mapping spinal cord locomotor circuits. Frontiers in Neural Circuits. 12, 60 (2018).
  26. Harrison, M., et al. Vertebral landmarks for the identification of spinal cord segments in the mouse. NeuroImage. 68, 22-29 (2013).
  27. Tang, X. Q., Heron, P., Mashburn, C., Smith, G. M. Targeting sensory axon regeneration in adult spinal cord. The Journal of Neuroscience. 27 (22), 6068-6078 (2007).
  28. Cameron, A. A., Smith, G. M., Randall, D. C., Brown, D. R., Rabchevsky, A. G. Genetic manipulation of intraspinal plasticity after spinal cord injury alters the severity of autonomic dysreflexia. The Journal of Neuroscience. 26 (11), 2923-2932 (2006).
  29. Liu, Y., Keefe, K., Tang, X., Lin, S., Smith, G. M. Use of self-complementary adeno-associated virus serotype 2 as a tracer for labeling axons: Implications for axon regeneration. PLoS One. 9 (2), e87447 (2014).
  30. Chamberlin, N. L., Du, B., de Lacalle, S., Saper, C. B. Recombinant adeno-associated virus vector: Use for transgene expression and anterograde tract tracing in the CNS. Brain Research. 793 (1-2), 169-175 (1998).
  31. Filli, L., et al. Bridging the gap: A reticulo-propriospinal detour bypassing an incomplete spinal cord injury. The Journal of Neuroscience. 34 (40), 13399-13410 (2014).
  32. Williams, R. R., Pearse, D. D., Tresco, P. A., Bunge, M. B. The assessment of adeno-associated vectors as potential intrinsic treatments for brainstem axon regeneration. The Journal of Gene Medicine. 14 (1), 20-34 (2012).
  33. Smith, G. M., Onifer, S. M. Construction of pathways to promote axon growth within the adult central nervous system. Brain Research Bulletin. 84 (4-5), 300-305 (2011).
  34. Morcuende, S., Delgado-Garcia, J. M., Ugolini, G. Neuronal premotor networks involved in eyelid responses: Retrograde transneuronal tracing with rabies virus from the orbicularis oculi muscle in the rat. The Journal of Neuroscience. 22 (20), 8808-8818 (2002).
  35. Ugolini, G. Specificity of rabies virus as a transneuronal tracer of motor networks: Transfer from hypoglossal motoneurons to connected second-order and higher order central nervous system cell groups. The Journal of Comparative Neurology. 356 (3), 457-480 (1995).
  36. Gelderd, J. B., Chopin, S. F. The vertebral level of origin of spinal nerves in the rat. The Anatomical Record. 188 (1), 45-47 (1977).
  37. Inquimbert, P., Moll, M., Kohno, T., Scholz, J. Stereotaxic injection of a viral vector for conditional gene manipulation in the mouse spinal cord. Journal of Visualized Experiments. 73, e50313 (2013).
  38. Carbajal, K. S., Weinger, J. G., Whitman, L. M., Schaumburg, C. S., Lane, T. E. Surgical transplantation of mouse neural stem cells into the spinal cords of mice infected with neurotropic mouse hepatitis virus. Journal of Visualized Experiments. 53, e2834 (2011).
  39. Snyder, B. R., et al. Comparison of adeno-associated viral vector serotypes for spinal cord and motor neuron gene delivery. Human Gene Therapy. 22 (9), 1129-1135 (2011).
  40. Cronin, J., Zhang, X. Y., Reiser, J. Altering the tropism of lentiviral vectors through pseudotyping. Current Gene Therapy. 5 (4), 387-398 (2005).
  41. Reed, W. R., Shum-Siu, A., Onifer, S. M., Magnuson, D. S. Inter-enlargement pathways in the ventrolateral funiculus of the adult rat spinal cord. 神经科学. 142 (4), 1195-1207 (2006).
  42. Mao, X., Schwend, T., Conrad, G. W. Expression and localization of neural cell adhesion molecule and polysialic acid during chick corneal development. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (3), 1234-1243 (2012).
  43. Charles, P., et al. Negative regulation of central nervous system myelination by polysialylated-neural cell adhesion molecule. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (13), 7585-7590 (2000).
  44. Tervo, D. G., et al. A designer AAV variant permits efficient retrograde access to projection neurons. Neuron. 92 (2), 372-382 (2016).
  45. Tohyama, T., et al. Contribution of propriospinal neurons to recovery of hand dexterity after corticospinal tract lesions in monkeys. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (3), 604-609 (2017).
  46. Liu, Y., et al. A sensitized IGF1 treatment restores corticospinal axon-dependent functions. Neuron. 95 (4), 817-833 (2017).
  47. Kinoshita, M., et al. Genetic dissection of the circuit for hand dexterity in primates. Nature. 487 (7406), 235-238 (2012).

Tags

Lentiviral VectorSpinal CordMotor PathwaysViral VectorGenetic MaterialNeural CircuitsDirect InjectionL1 To L4 Spinal LevelsMicromanipulatorAnesthetized RatSkin IncisionSpinous ProcessesRat Tooth Forceps

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Keefe, K. M., Junker, I. P., Sheikh, I. S., Campion, T. J., Smith, G. M. Direct Injection of a Lentiviral Vector Highlights Multiple Motor Pathways in the Rat Spinal Cord. J. Vis. Exp. (145), e59160, doi:10.3791/59160 (2019).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image