الحقن المباشر لناقل لينتيفيرال يسلط الضوء على عدة مسارات الحركية في الحبل الشوكي الفئران
Summary
هذا البروتوكول يوضح حقن ناقل فيروسي ريتروجراديلي قابلة للنقل في أنسجة النخاع الشوكي الفئران. تناولها في المشبك الناقل ونقلها إلى الجسم خلية من الخلايا العصبية المستهدفة. هذا النموذج مناسبة لاقتفاء أثر رجعي مسارات العمود الفقري هامة أو استهداف الخلايا لتطبيقات العلاج الجيني.
Abstract
إدخال البروتينات ذات الاهتمام في الخلايا في الجهاز العصبي يشكل تحديا بسبب الحواجز البيولوجية الفطرية التي تحد من الوصول إلى معظم الجزيئات. تتجاوز هذه الحواجز، وتوفير إمكانية الوصول إلى الأجهزة المحمولة الحقن مباشرة في أنسجة النخاع الشوكي أو synapses حيث يمكن إدراج الجزيئات. الجمع بين التكنولوجيا النواقل الفيروسية مع هذا الأسلوب يسمح لإدخال الجينات المستهدفة في النسيج العصبي غرض العلاج الجيني أو تتبع المسالك. هنا هو عرض فيروس هندسيا للنقل إلى الوراء ذات كفاءة عالية (حرية) عند نهايات من بروبريوسبينال إينتيرنيورونس (السندات الإذنية) لتشجيع النقل المحددة للخلايا العصبية في الحبل الشوكي ونوى جذع الدماغ. استهداف السندات الإذنية يستفيد من الاتصالات العديدة التي يتلقونها من مسارات السيارات مثل مساحات روبروسبينال وريتيكولوسبينال، فضلا عن بالترابط مع بعضها البعض في جميع أنحاء أجزاء الحبل الشوكي. الممثل التتبع باستخدام ناقلات هيريت مع تفاصيل عالية الدقة يظهر البروتين active مؤثرا الفلورية الخضراء (بروتينات فلورية خضراء) الهيئات الخلية ومحاور عصبية والعرش الجذعية في السندات الإذنية والصدر وفي الخلايا العصبية ريتيكولوسبينال في تشكيل شبكي البوتانية. حرية جيدا ودمج مسارات جذع الدماغ والجهاز العصبي المحيطي ولكن يظهر الاندماج يتوقف العمر في المسالك كورتيكوسبينال الخلايا العصبية. وخلاصة القول، حقن الحبل الشوكي باستخدام النواقل الفيروسية طريقة مناسبة لإدخال البروتينات ذات الاهتمام في الخلايا العصبية لمساحات محددة الأهداف.
Introduction
النواقل الفيروسية هي أدوات البيولوجية الهامة التي يمكن إدخال المواد الجينية في الخلايا من أجل التعويض عن الجينات المعيبة، بروتينات النمو الهام upregulate أو صنع البروتينات العلامة التي تسلط الضوء على هيكل واتصالات متشابك من أهدافها. تركز هذه المقالة على الحقن المباشر لناقل لينتيفيرال ريتروجراديلي القابلة للنقل ذات كفاءة عالية في الحبل الشوكي الفئران بغية تسليط الضوء على مسارات السيارات الرئيسية مع تتبع الفلورسنت. هذا الأسلوب هو أيضا مناسب جداً لدراسات التجديد وإعادة نمو محواري ﻹدخال البروتينات لمصلحة السكان متنوعة من الخلايا العصبية، وقد استخدمت لإسكات الخلايا العصبية لرسم الخرائط الوظيفية الدراسات1،2.
كثير من التفاصيل التشريحية للعمود الفقري مسارات السيارات تم توضيحها من خلال دراسات الحقن المباشر مع تتبع الكلاسيكية مثل BDA ومخفضات والذهب3،،من45،،من67 , 8-تتبع هذه تعتبر معيار الذهب ولكن قد يكون بعض العيوب مثل الإقبال بمحاور عصبية تالفة، أو محاور عصبية في ممر في هذا الشأن البيضاء المحيطة بحقن الموقع9،10،11 . وهذا يمكن أن يؤدي إلى تفسيرات خاطئة لمسار الاتصال وقد يكون هناك عيب في دراسات التجديد حيث يمكن أن يكون مخطئا امتصاص الصبغة بواسطة محاور عصبية معطوبة أو مقطوعة لتجديد الألياف أثناء تحليل لاحق12.
لينتيفيرال الناقلة شعبية في دراسات العلاج الجيني، كما أنها توفر التعبير مستقرة وطويلة الأمد في السكان العصبية13،،من1415،،من1617،18 ،19. بيد ناقلات لينتيفيرال تقليديا المعلبة يمكن حدت من النقل إلى الوراء وقد تؤدي إلى استجابة الجهاز المناعي عند استخدامها في فيفو4،،من2021. وتنتج ناقل نقل إلى الوراء ذات كفاءة عالية ووصف حرية كاتو et al. بتعديل المغلف الفيروسي مع داء فيروس بروتين سكري لإنشاء ناقل هجينة التي تعمل على تحسين النقل إلى الوراء22،23.
اقتفاء أثر رجعي يدخل متجه إلى مساحة متشابك لخلية الهدف، مما يسمح لها أن تتناولها إكسون تلك الخلية ونقلها إلى جسم الخلية. قد ثبت النقل الناجح حرية من نهايات الخلايا العصبية في أدمغة الفئران والقرود23،24 ومن العضلات في الخلايا العصبية الحركية22. هذا البروتوكول يوضح حقن في الحبل الشوكي القطني، تستهدف على وجه التحديد محطات متشابك إينتيرنيورونس بروبريوسبينال والخلايا العصبية في الدماغ. السندات الإذنية تلقي اتصالات من العديد من مسارات مختلفة العمود الفقري وهكذا يمكن أن تستخدم لاستهداف سكان متنوعة من الخلايا العصبية في الحبل الشوكي والدماغ. تسمية الخلايا العصبية في هذه الدراسة تمثل الدوائر إينيرفاتينج تجمعات الخلايا العصبية الحركية المتصلة بوظيفة الحركة اللكتات. ويعتبر وسم قوية في الحبل الشوكي وجذع الدماغ، بما في ذلك تفاصيل عالية الدقة للعرش الجذعية ومحطات إكسون. كما أننا استخدمنا هذا الأسلوب في الدراسات السابقة داخل الحبل الشوكي عنق الرحم لتسمية بروبريوسبينال والدماغ ريتيكولوسبينال مسارات25.
هذا البروتوكول يوضح ضخ النواقل الفيروسية في الحبل الشوكي القطني من الفئران. كما يظهر في الفيلم 1، يستهدف الشق طريق تحديد فقرة L1 يقع في الضلع الأخير. وهذا كعلامة بارزة والذيلية لشق سم 3-4 الذي يعرض الجهاز العضلي عبر الحبل الشوكي L1-L4. تتم لامينيكتوميس جوانب الظهرية لفقرات T11 T13 ويوجه إبرة زجاج مشطوف الوحشي 0.8 ملم من خط الوسط وخفض 1.5 مم عمق الرمادية لحقن الفيروس.
Protocol
Representative Results
Discussion
المعالجة الجينية للخلايا العصبية في المخ والحبل الشوكي عملت على تسليط الضوء، الحسية والحركية ومسارات الاستقلال الذاتي عن طريق تتبع الفلورسنت، واستكشاف إمكانات نمو مساحات الخلايا العصبية بعد إصابة27،28، 29 , 30 , <sup …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم تمويل هذا العمل بمنحه مقدمة من المعهد الوطني للاضطرابات العصبية والسكتة الدماغية R01 R01NS103481 ومستشفى شرينيرس “بحوث طب الأطفال” منح برنامج العسر الشديد 84051 وحالات العسر الشديد 86000 ووزارة الدفاع (SC140089).
Materials
| #10 Scalpel Blades | Roboz | RS-9801-10 | For use with the scalpel. |
| 1 mL Syringes | Becton, Dickinson and Company | 309659 | For anesthetic IP injection, potential anesthetic booster shots, and antibiotic injections. |
| 10mL Syringes | Becton, Dickinson and Company | 309604 | For injecting saline into the animal, post-surgery. |
| 4.0 Chromic Catgut Suture | DemeTECH | NN374-16 | To re-bind muscle during closing. |
| 48000 Micropipette Beveler | World Precision Instruments | 32416 | Used to bevel the tips of the pulled glass capillary tubes to form functional glass needles. |
| 5% Iodine Solution | Purdue Products L.P. | L01020-08 | For use in sterilzation of the surgical site. |
| 70% Ethanol | N/A | N/A | For sterilization of newly prepared glass needles, animal models during surgical preparation, and surgeon's hands during surgery, as well as all other minor maintainances of sterility. |
| Anesthetic (Ketamine/Xylazine Solution) | Zoetis | 240048 | For keeping the animal in the correct plane of consciousness during surgery. |
| Antibiotic (Cefazolin) | West-Ward Pharmaceuticals | NPC 0143-9924-90 | To be injected subcutaneously to prevent infection post-surgery. |
| Bead Sterilizer | CellPoint | 5-1450 | To heat sterilize surgical instruments. |
| Bonewax | Fine Science Tools | 19009-00 | To seal up bone in the case of bone bleeding. |
| Cauterizer | Fine Science Tools | 18010-00 | To seal any arteries or veins severed during surgery to prevent excessive blood loss. |
| Digital Scale | Okaus | REV.005 | For weighing the animal during surgical preparation. |
| Flexible Needle Attachment | World Precision Instruments | MF34G-5 | For cleaning glass needles and loading red oil into glass needles. |
| Gelfoam | Pfizer | H68079 | To seal up bone in the case of bone bleeding. |
| Glass Capillary Tubes | World Precision Instruments | 4878 | For pulled glass needles – should be designed for nanoliter injectors. |
| Hair Clippers | Oster | 111038-060-000 | For clearing the surgical site of hair. |
| Hemostats | Roboz | RS-7231 | For general use in surgery. |
| Kimwipes | Kimtech | 34155 | For general use in surgery. |
| Medium Point Curved Forceps | Roboz | RS-5136 | For general use in surgery. |
| Micromanipulator with a Vernier Scale | Kanetec | N/A | For precise targeting during surgery. |
| Microscissors | Roboz | RS-5621 | For cutting glass whisps off of freshly pulled glass capillary tubes. |
| Microscope with Light and Vernier Scale Ocular | Leitz Wetzlar | N/A | Used to visualize and measure beveling of pulled glass capillary tubes into functional glass needles. |
| MicroSyringe Pump Controller | World Precision Instruments | 62403 | To control the rate of injection. |
| Nanoliter 2000 Pump Head Injector | World Precision Instruments | 500150 | To load and inject virus in a controlled fashion. |
| Needle Puller | Narishige | PC-100 | To heat and pull apart glass capillary tubes to form glass needles. |
| Ophthalamic Ointment | Dechra Veterinary Products | RAC 0119 | To protect the animal's eyes during surgery. |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | To assist with loading virus into the nanoinjector. |
| PrecisionGlide Needles (25G x 5/8) | Becton, Dickinson and Company | 305122 | For use with the 1mL and 10 mL syringes to allow injection of the animal model. |
| Rat Tooth Forceps | Roboz | RS-5152 | For griping spinous processes. |
| Red Oil | N/A | N/A | To provide a front for visualization of virus entering tissue during injection. |
| Retractors | Roboz | RS-6510 | To hold open the surgical wound. |
| Rimadyl Tablets | Bio Serv | MP275-050 | For pain management post-surgery. |
| Rongeurs | Roboz | RS-8300 | To remove muscle from the spinal column during surgery. |
| Scalpel Blade Handle | Roboz | RS-9843 | To slice open skin and fat pad of animal model during surgery. |
| Scissors | Roboz | RS-5980 | For general use in surgery. |
| Stainless Steal Wound Clips | CellPoint | 201-1000 | To bind the skin of the surgical wound during closing. |
| Staple Removing Forceps | Kent Scientific | INS750347 | To remove the staples, should they be applied incorrectly. |
| Sterile Cloth | Phenix Research Products | BP-989 | To provide a sterile surface for the operation. |
| Sterile Cotton-Tipped Applicators | Puritan | 806-WC | To soak up blood in the surgical wound while maintaining sterility. |
| Sterile Gauze | Covidien | 2146 | To clean the surgical area and surgical tools while maintaining sterility. |
| Sterile Saline | Baxter Healthcare Corporation | 281324 | For use in blood clearing, and for replacing fluids post-surgery. |
| Surgical Gloves | N/A | N/A | For use by the surgeon to maintain sterile field during surgery. |
| Surgical Heating Pad | N/A | N/A | For maintaining the body temperature of the animal model during surgery. |
| Surgical Microscope | N/A | N/A | For enhanced visualization of the surgical wound. |
| Surgical Stapler | Kent Scientific | INS750546 | To apply the staples. |
| T/Pump Heat Therapy Water Pump | Gaymar | TP500C | To pump warm water into the water convection warming pad. |
| Water Convection Warming Pad | Baxter Healthcare Corporation | L1K018 | For use in the post-operational recovery area to maintain the body temperature of the unconscious animal. |
| Weighted Hooks | N/A | N/A | To hold open the surgical wound. |
References
- Wang, X., et al. Deconstruction of corticospinal circuits for goal-directed motor skills. Cell. 171 (2), 440-455 (2017).
- Kinoshita, M., et al. Genetic dissection of the circuit for hand dexterity in primates. Nature. 487 (7406), 235-238 (2012).
- Brichta, A. M., Grant, G. Cytoarchitectural organization of the spinal cord. The rat nervous system. Vol. 2, hindbrain and spinal cord. , (1985).
- Liang, H., Paxinos, G., Watson, C. Projections from the brain to the spinal cord in the mouse. Brain Structure & Function. 215 (3-4), 159-186 (2011).
- Rexed, B. The cytoarchitectonic organization of the spinal cord in the cat. The Journal of Comparative Neurology. 96 (3), 414-495 (1952).
- Schmued, L. C., Fallon, J. H. Fluoro-gold: A new fluorescent retrograde axonal tracer with numerous unique properties. Brain Research. 377 (1), 147-154 (1986).
- Veenman, C. L., Reiner, A., Honig, M. G. Biotinylated dextran amine as an anterograde tracer for single- and double-labeling studies. Journal of Neuroscience Methods. 41 (3), 239-254 (1992).
- Watson, C., Paxinos, G., Kayalioglu, G., Heise, C. Atlas of the rat spinal cord. The spinal cord. , 238-306 (2009).
- Brandt, H. M., Apkarian, A. V. Biotin-dextran: A sensitive anterograde tracer for neuroanatomic studies in rat and monkey. Journal of Neuroscience Methods. 45 (1-2), 35-40 (1992).
- Geed, S., van Kan, P. L. E. Grasp-based functional coupling between reach- and grasp-related components of forelimb muscle activity. Journal of Motor Behavior. 49 (3), 312-328 (2017).
- Reiner, A., Veenman, C. L., Medina, L., Jiao, Y., Del Mar, N., Honig, M. G. Pathway tracing using biotinylated dextran amines. Journal of Neuroscience Methods. 103 (1), 23-37 (2000).
- Steward, O., Zheng, B., Banos, K., Yee, K. M., et al. Response to: Kim et al., "axon regeneration in young adult mice lacking nogo-A/B." neuron 38, 187-199. Neuron. 54 (2), 191-195 (2007).
- Brown, B. D., et al. A microRNA-regulated lentiviral vector mediates stable correction of hemophilia B mice. Blood. 110 (13), 4144-4152 (2007).
- Lo Bianco, C., et al. Lentiviral vector delivery of parkin prevents dopaminergic degeneration in an alpha-synuclein rat model of parkinson’s disease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (50), 17510-17515 (2004).
- Malik, P., Arumugam, P. I., Yee, J. K., Puthenveetil, G. Successful correction of the human cooley’s anemia beta-thalassemia major phenotype using a lentiviral vector flanked by the chicken hypersensitive site 4 chromatin insulator. Annals of the New York Academy of Sciences. 1054, 238-249 (2005).
- Pawliuk, R., et al. Correction of sickle cell disease in transgenic mouse models by gene therapy. Science. 294 (5550), 2368-2371 (2001).
- Wang, G., et al. Feline immunodeficiency virus vectors persistently transduce nondividing airway epithelia and correct the cystic fibrosis defect. The Journal of Clinical Investigation. 104 (11), R55-R62 (1999).
- Liang, H., Paxinos, G., Watson, C. The red nucleus and the rubrospinal projection in the mouse. Brain Structure & Function. 217 (2), 221-232 (2012).
- Abdellatif, A. A., et al. delivery to the spinal cord: comparison between lentiviral, adenoviral, and retroviral vector delivery systems. Journal of Neuroscience Research. 84 (3), 553-567 (2010).
- DePolo, N. J., et al. VSV-G pseudotyped lentiviral vector particles produced in human cells are inactivated by human serum. Molecular Therapy. 2 (3), 218-222 (2000).
- Higashikawa, F., Chang, L. Kinetic analyses of stability of simple and complex retroviral vectors. Virology. 280 (1), 124-131 (2001).
- Hirano, M., Kato, S., Kobayashi, K., Okada, T., Yaginuma, H., Kobayashi, K. Highly efficient retrograde gene transfer into motor neurons by a lentiviral vector pseudotyped with fusion glycoprotein. PLoS One. 8 (9), e75896 (2013).
- Kato, S., et al. A lentiviral strategy for highly efficient retrograde gene transfer by pseudotyping with fusion envelope glycoprotein. Human Gene Therapy. 22 (2), 197-206 (2011).
- Kato, S., et al. Selective neural pathway targeting reveals key roles of thalamostriatal projection in the control of visual discrimination. The Journal of Neuroscience. 31 (47), 17169-17179 (2011).
- Sheikh, I. S., Keefe, K. M., et al. Retrogradely transportable lentivirus tracers for mapping spinal cord locomotor circuits. Frontiers in Neural Circuits. 12, 60 (2018).
- Harrison, M., et al. Vertebral landmarks for the identification of spinal cord segments in the mouse. NeuroImage. 68, 22-29 (2013).
- Tang, X. Q., Heron, P., Mashburn, C., Smith, G. M. Targeting sensory axon regeneration in adult spinal cord. The Journal of Neuroscience. 27 (22), 6068-6078 (2007).
- Cameron, A. A., Smith, G. M., Randall, D. C., Brown, D. R., Rabchevsky, A. G. Genetic manipulation of intraspinal plasticity after spinal cord injury alters the severity of autonomic dysreflexia. The Journal of Neuroscience. 26 (11), 2923-2932 (2006).
- Liu, Y., Keefe, K., Tang, X., Lin, S., Smith, G. M. Use of self-complementary adeno-associated virus serotype 2 as a tracer for labeling axons: Implications for axon regeneration. PLoS One. 9 (2), e87447 (2014).
- Chamberlin, N. L., Du, B., de Lacalle, S., Saper, C. B. Recombinant adeno-associated virus vector: Use for transgene expression and anterograde tract tracing in the CNS. Brain Research. 793 (1-2), 169-175 (1998).
- Filli, L., et al. Bridging the gap: A reticulo-propriospinal detour bypassing an incomplete spinal cord injury. The Journal of Neuroscience. 34 (40), 13399-13410 (2014).
- Williams, R. R., Pearse, D. D., Tresco, P. A., Bunge, M. B. The assessment of adeno-associated vectors as potential intrinsic treatments for brainstem axon regeneration. The Journal of Gene Medicine. 14 (1), 20-34 (2012).
- Smith, G. M., Onifer, S. M. Construction of pathways to promote axon growth within the adult central nervous system. Brain Research Bulletin. 84 (4-5), 300-305 (2011).
- Morcuende, S., Delgado-Garcia, J. M., Ugolini, G. Neuronal premotor networks involved in eyelid responses: Retrograde transneuronal tracing with rabies virus from the orbicularis oculi muscle in the rat. The Journal of Neuroscience. 22 (20), 8808-8818 (2002).
- Ugolini, G. Specificity of rabies virus as a transneuronal tracer of motor networks: Transfer from hypoglossal motoneurons to connected second-order and higher order central nervous system cell groups. The Journal of Comparative Neurology. 356 (3), 457-480 (1995).
- Gelderd, J. B., Chopin, S. F. The vertebral level of origin of spinal nerves in the rat. The Anatomical Record. 188 (1), 45-47 (1977).
- Inquimbert, P., Moll, M., Kohno, T., Scholz, J. Stereotaxic injection of a viral vector for conditional gene manipulation in the mouse spinal cord. Journal of Visualized Experiments. 73, e50313 (2013).
- Carbajal, K. S., Weinger, J. G., Whitman, L. M., Schaumburg, C. S., Lane, T. E. Surgical transplantation of mouse neural stem cells into the spinal cords of mice infected with neurotropic mouse hepatitis virus. Journal of Visualized Experiments. 53, e2834 (2011).
- Snyder, B. R., et al. Comparison of adeno-associated viral vector serotypes for spinal cord and motor neuron gene delivery. Human Gene Therapy. 22 (9), 1129-1135 (2011).
- Cronin, J., Zhang, X. Y., Reiser, J. Altering the tropism of lentiviral vectors through pseudotyping. Current Gene Therapy. 5 (4), 387-398 (2005).
- Reed, W. R., Shum-Siu, A., Onifer, S. M., Magnuson, D. S. Inter-enlargement pathways in the ventrolateral funiculus of the adult rat spinal cord. 神经科学. 142 (4), 1195-1207 (2006).
- Mao, X., Schwend, T., Conrad, G. W. Expression and localization of neural cell adhesion molecule and polysialic acid during chick corneal development. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (3), 1234-1243 (2012).
- Charles, P., et al. Negative regulation of central nervous system myelination by polysialylated-neural cell adhesion molecule. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (13), 7585-7590 (2000).
- Tervo, D. G., et al. A designer AAV variant permits efficient retrograde access to projection neurons. Neuron. 92 (2), 372-382 (2016).
- Tohyama, T., et al. Contribution of propriospinal neurons to recovery of hand dexterity after corticospinal tract lesions in monkeys. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (3), 604-609 (2017).
- Liu, Y., et al. A sensitized IGF1 treatment restores corticospinal axon-dependent functions. Neuron. 95 (4), 817-833 (2017).
- Kinoshita, M., et al. Genetic dissection of the circuit for hand dexterity in primates. Nature. 487 (7406), 235-238 (2012).
