シロイヌナズナの取付汎用性の高い方法は、生体のタイムラプス イメージングの葉します。

注: それは睡眠を防ぐために重要なタイムラプス イメージング中にリビングの葉の動きをサンプリングします。葉の機械的応力を最小限に抑えるため、葉の穏やかな固定が必要です。唯一の適切に準備された葉のサンプル様々 な画像解析に適したタイムラプス画像を生成します。PR1遺伝子プロモーター (pPR1 YFP NLS 植物) と腐太陽光発電の制御の下でNLS YFP融合形質転換シロイヌナズナ植物を使用してプロトコル。トマトDC3000 (avrRpt2) 株 (Pst_a2) を例として説明します。 1 植物と病原体の準備 オートクレーブ土とプラスチック電池プラグ トレイ (資材表) を入力します。 セル (図 1A) あたり 1 つの形質転換シロイヌナズナ種子をまきます。 23 ° C で維持成長部屋にトレイを転送し、2-3 週間連続の白色光の下で植物を育てます。 病原体接種前 2 日間は連勝腐pv です。トマトDC3000 avrRpt2は、NYG 媒体 (ペプトン 5 g/L、3 g/L 酵母エキス、グリセリン 20 mL/L、15 g/L 細菌寒天、pH 7.0) 含む 100 mg/L リファンピシンおよび 50 mg/L カナマイシンにグリセロール ストックから (Pst_a2) を負担し、48 h 28 ° C の孵化させなさい。 プラスチックの先端を使用して媒体の表面に表示される細菌細胞を採取、10 mM MgCl2を含むプラスチック製のチューブに転送、再懸濁します。600 で溶液の光学濃度 (OD) を測定 (外径600) nm。108コロニー形成単位 (CFU) 細菌細胞の最終的な細胞濃度を調整/外径600に通常対応する mL = 0.211。 2. 病原体接種 植物を傷つけることがなく 2-3 週齢の工場を含むセル プラグを慎重にカットします。空のセルのプラグトレイにセルを設定 (2 x 2 細胞は十分な) (図 1B) の良いバランスを維持します。 接種のため目に見えて健康的な葉を選択します。一般に、第 3、第 4、および第 5 葉 (#3 #4、#5図 1Cにそれぞれ) 植物の底から、扱いやすい。使用の良い再現性の実験のセットで同じ位置にある葉します。水土壌の長期のタイムラプス イメージング接種前に植物を保持します。 必要に応じて、 pPR1などストレス応答性プロモーターの解析の場合、植物、自然を強調したないように YFP シグナルの不在を確認する病原体接種前蛍光顕微鏡下葉を調べます。除外は、実験から示す YFP シグナルを残します。 病原体と直接接触を避けるために浸潤する前に使い捨てラテックス手袋を着用します。細菌懸濁液を葉の背軸側に潜入 1 mL 無針プラスチックのシリンジを使用して慎重に (108 CFU/mL)11 (図 1D)。葉の半分上の小さな部分の接種はpPR1活動の良い可視化を実現にします。浸透した地域が残りの葉と比較して色の濃い緑として表示されます。非常に浸潤時に葉に機械的な損傷が発生しないように注意します。注: 必ず浸透した地域にある全ての細胞間スペースが完全に病原体のサスペンションと成就 (垂直方向)それ以外の場合、PCD ドメインは蛍光顕微鏡の下で視覚化することは困難になります。これは単に浸透した地域における暗い緑化の完了によって確認できます。 柔らかい紙タオルで浸透した葉の浸透したセクションを周囲から細菌懸濁液の過剰を吸収します。 3. 接種葉の取付 接種後すぐに浸透した葉は、スライド ガラスの中央に位置して、サージカル テープ (資材表) を使用してプラスチック製のトレイをスライド ガラスを修正します。ガラス スライド (図 2A) 内接種葉身が完全に取り付けられていることを確認します。 二重プラスチック テープを準備 (0.2 mm 厚のテープの場合材料の表を参照) と 2 つにカット部分 (図 2B; 1 と 2 の部分) 浸透した葉の葉柄に沿ってスペースに合うように。図 2B図 2Aに示すように両方向矢印の長さに収まるように両方向の矢印で示されているこれらの 2 つの部分の長さを配置します。注: 2 つの部分のそれぞれからコーナーを切断葉身への損傷を回避できます (図 2B矢印; また 3.4 以下の手順を参照してください)。同じような厚さのプラスチック テープの任意の種類は、橋をかけて、葉柄に適しています。プラスチック テープの剛性は、次に示す手順の中に簡単に処理にとって重要です。 各部分のカットのコーナーに合わせます (図 2C) 葉身の基部とそのテープ作品 1 と葉柄のどちら側でも 2 の棒高級ピンセットのペアを使用して。テープ部分には葉柄や葉の刃が触れないことを確認します。注: 葉身の基部にこれらのプラスチック テープの二重部分はスペーサーとして機能し、取付中の葉柄に物理的なストレスを防ぐ。 図 2Bの両方向矢印のサイズに合わせて、テープ作品 1 と葉柄 (上にブリッジを形成する 2 の上に固執する二重プラスチック テープ (図 2B3 の部分) の追加部分を準備します。図 2D, E)。図 2D、Eで矢印で示された位置にテープ部分の直接間葉柄と葉のブレードをひかないように非常に注意します。 優しくサージカル テープ (図 2F作品 4) 葉身の先端スライド ガラス上の小片を貼るようなこと葉身は非常にそっとスライド ガラスに固定します。だけ強く押しガラス スライド (図 2F、赤色の破線で囲まれた領域) に直接触れるサージカル テープの部分、ない葉を覆う他の部分。 優しく、葉柄の国境でサージカル テープ (図 2G5 の部分) の別の小さい部分をスティックし、プラスチック テープ、その葉柄非常にそっとスライド ガラスとプラスチック テープの両方に作品を修正です (1、2、および 3) を個セットします。だけしっかりとスライド ガラスとプラスチック テープ部分 (図 2G、赤色の破線で囲まれた領域) にスライド ガラスに直接触れる施術の一部を添付しない葉柄を覆う他の部分。 200 μ L ピペット チップ (図 2H) を使用して顕微鏡の視野に移動するから隣接葉を防ぐため。優しく浸透した葉から近隣の葉を保持するために土壌にピペット チップを挿入します。可能なルート損傷を避けるため土壌に深く入りすぎてヒントを挿入しないように注意します。メモ: 準備の植物、蛍光顕微鏡イメージングのため準備ができています。 4. 顕微鏡によるタイムラプス観察 蛍光実体顕微鏡を入れます。注: ここでは、自動顕微鏡 1.4 メガピクセルの高感度モノクロ 12 ビット モードでデジタル カメラを使用装備 (材料表)。顕微鏡は、タイムラプス イメージング中に 23 ° C で室温を維持するために十分な換気とエアコン ユニットが装備暗い部屋または暗いキャビネットに配置必要があります。 イメージングのための顕微鏡の対物レンズの下の上のスペースで植物を設定します。 タイムラプス イメージング用パラメーターを設定 (表 1の例を参照してください)。露光のプログラム ステップ光植物免疫12の主要な影響を持っているので、時間経過イメージ投射の間隔期間中を確認してをください。 従来の YFP フィルター (励起 500 520 nm; 排出量 540-580 nm) を使用して、YFP シグナルを視覚化します。 (励起 540-580 nm; 排出量 610 nm ロングパス) PCD ドメインが YFP 陽性細胞層9 (図 3に囲まれた暗い領域 (蛍光なし) として表示されるように、クロロフィルの自家蛍光を視覚化するテキサス赤 (TXR) フィルターを使用します。A)。 手順の追加の光暴露従来エピ明るいフィールドの設定を使用します。注: 実験前に、エピ明るい光源のパワーを測定し、自分の植物の成長の条件のレベルに調整。 タイムラプス イメージング プログラムを実行します。数日間で長期的な観測は、たとえば、露光ステップの間に、適切な植物の水まきを検討してください。 画像取り込み後余分なチャンネル用光照射間隔 (表1 3 8 チャンネルに対応) でデータ セットからを省略します。フィジー9など別の画像解析ソフトウェアを使用して、関心領域 (ROI) 分析など、さまざまな方法でデータを分析します。