Visualizzazione fluorescente dell'RNA marcato al mango nei gel di poliacrilofofora tramite un metodo poststaino

Il mango è un sistema di etichettatura dell’RNA costituito da un insieme di quattro piccoli aptamer fluorescenti RNA che si legano strettamente (rilegamento nanomolare) a semplici derivati del tiazolo-arancione (TO1-Biotin, Figura 1A)^1,2,3 . Al momento del legame, la fluorescenza di questo ligando viene aumentata da 1.000 a 4.000 volte a seconda dell’aptamero specifico. L’elevata luminosità del sistema Mango, che per Mango III supera quella della proteina fluorescente verde potenziata (eGFP), combinata con l’affinità di legame nanomolare degli aptamori RNA Mango, lo permette di essere utilizzato sia nell’imaging che nella purificazione dell’RNA complessi^2,4.

Le strutture a raggi X di Mango I⁵, II⁶e III⁷ sono state determinate ad alta risoluzione, e tutti e tre i pulsanti utilizzano un quadruplex di RNA per legare TO1-Biotin (Figura 1B–D). I nuclei compatti di tutti e tre gli aptamers sono isolati dalla sequenza esterna dell’RNA tramite motivi di adattatore compatto. Mango I e II utilizzano entrambi un adattatore di loop flessibile simile a GNRA per collegare i loro nuclei di Mango a un duplex DI RNA arbitrario (Figura 1B, C). Al contrario, Mango III utilizza un motivo triplex rigido per collegare il suo nucleo a un’elica arbitraria dell’RNA (Figura 1D, residui viola), mentre la struttura di Mango IV non è attualmente nota. Poiché il nucleo legante del ligando di ciascuno di questi aptamers è separato dalla sequenza esterna di RNA da questi adattatori elicoidali, sembra probabile che tutti possano essere semplicemente incorporati in una varietà di RNA. L’RNA regolatore 6S batterico (Mango I), i componenti del lievito spicchio (Mango I), e l’RNA umano 5S, U6 RNA, e uno scaRNA C/D (Mango II e IV) sono stati tutti etichettati con successo in questo modo^2,8, suggerendo che molti gli RNA biologici possono essere etichettati utilizzando il sistema di aptameri RNA Mango.

Denatura e gel nativi sono comunemente utilizzati per studiare gli RNA. I gel di denatura sono spesso usati per giudicare la dimensione dell’RNA o l’elaborazione dell’RNA, ma in genere, nel caso di una macchia settentrionale, ad esempio, richiedono diversi passaggi lenti e sequenziali per generare un’immagine. Mentre altri aptameri fluorogeni dell’RNA, come RNA Spinach e Broccoli, sono stati utilizzati con successo per l’imaging in gel⁹, nessun sistema di aptameri fluorogenico fino ad oggi possiede l’elevata luminosità e affinità del sistema Mango, rendendolo di notevole interesse per studiare le capacità di imaging gel di Mango. In questo studio, ci siamo chiesti se il sistema RNA Mango potesse essere semplicemente esteso all’imaging gel, poiché le lunghezze d’onda di eccitazione ed emissione di TO1-Biotin (510 nm e 535 nm, rispettivamente) sono appropriate per l’imaging nel canale eGFP comune alla maggior parte fluorescente strumentazione di scansione gel.

Il protocollo di colorazione post-gel qui presentato fornisce un modo rapido per rilevare specificamente le molecole di RNA etichettate con mango nei gel nativi e denatura del gel poliacrilammide (PAGE). Questo metodo di colorazione prevede gel di ammollo in un buffer contenente potassio e TO1-Biotina. Gli aptamers RNA Mango sono a base di G-quadruplex e il potassio è necessario per stabilizzare tali strutture. Utilizzando l’RNA trascritto da modelli minimi di DNA che codificano mango (vedi la sezione del protocollo), possiamo semplicemente rilevare appena 62,5 fmol di RNA nei gel nativi e 125 fmol di RNA nei gel di denatura, utilizzando un protocollo di colorazione semplice. A differenza delle comuni macchie di acido nucleico non specifico (vedi Tabella dei materiali, riferite a SG da qui), possiamo identificare chiaramente l’RNA affettato dal mango anche quando nel campione sono presenti alte concentrazioni di RNA totale senza tag.