Spore-Adsorption als ein Nonrecombinant Display-System für Enzyme und Antigene

Display-Systeme sollen biologisch aktive Molekülen auf der Oberfläche von Mikroorganismen zu präsentieren und finden Anwendungen in den unterschiedlichsten Bereichen von Industrie, Medizin- und Umwelttechnik Biotechnologien. Neben Phagen^1,2 und Zellen von verschiedenen gram-positive Art^3,4,5,6,7, wurden ebenfalls Bakteriensporen als Display-Systeme von zwei Ansätze^8,9vorgeschlagen.

Wegen seiner besonderen Struktur, nämlich eine dehydrierte Zytoplasma umgeben von einer Reihe von Schutzschichten¹⁰, bietet die Spore mehrere Vorteile gegenüber Phagen und zellbasierte Display Systeme^8,9. Ein erste Vorteil ist die extreme Robustheit und Stabilität der Sporen zu Konditionen, die für alle anderen Zellen^10,11schädlich wäre. Spore-Anzeige Antigene und Enzyme sind stabil, nach längerer Lagerung bei Raumtemperatur¹² und vor Abbau bei niedrigem pH-Wert und hohen Temperaturen^{13 geschützt}. Ein zweiter Vorteil der Sporen ist die Sicherheit vieler Spore-bildenden Arten. B. Coagulans, B. Subtilis, B. Clausiiund mehrere andere Arten werden weltweit als Probiotika verwendet und wurden auf dem Markt für den menschlichen oder tierischen Einsatz für Jahrzehnte^14,15. Diese außergewöhnliche Sicherheitsbilanz ist eine offensichtliche allgemeine Voraussetzung für ein DGM-Anzeige-System und ist von besonderer Bedeutung, wenn das System für menschlichen oder tierischen Gebrauch¹⁶vorgesehen ist. Ein Drittel ist wichtiger Vorteil der eine Spore-basierte Display-System, dass es keinen Beschränkungen für die Größe des Moleküls, die ausgesetzt werden. In Phagen-basierten Systemen eine große heterologen Proteinen beeinträchtigen die Struktur der das Kapsid während in Zell-basierte Systeme, es kann Einfluss auf die Struktur der Membran oder Grenze/beeinträchtigen können die Membran Translokation Schritt¹⁷. Rund um die Spore Schutzschichten bestehen aus mehr als 70 verschiedene Proteine¹⁰ und sind flexibel genug, um große Fremdeiweiße ohne offensichtlich Konstruktionsfehler oder Funktionsbeeinträchtigung⁸akzeptieren. Darüber hinaus ist die Membran Translokation des heterologen Proteins mit beiden Spore-basierte Display-Systeme nicht erforderlich^8,9. In der Tat heterologen Proteine entweder in der Mutterzelle Zytoplasma hergestellt und montiert auf der Spore, die im gleichen Zytoplasma bildet oder adsorbiert an der Reifen Spore^8,9.

Spore-Anzeige wurde zunächst durch die Entwicklung einer genetischen Systems um die Spore Oberfläche¹⁸Ingenieur erhalten. Dieses genetische System beruhte auf i) den Bau einer gen-Fusion zwischen der gen-Codierung für eine Spore-Hüllprotein (verwendet als Träger) und für das Protein zu kodierenden gen angezeigt – die transkriptionelle und translationale Signale von der endogenen gen steuert den Ausdruck der Verschmelzung und Ii) Integration von Chimären gen auf dem Chromosom B. Subtilis , genetische Stabilität zu gewähren. Eine Vielzahl von Antigenen und Enzyme dieser rekombinanten Ansatz, mit verschiedenen Spore Oberflächenproteine als Träger und mit dem Ziel verschiedene Anwendungsmöglichkeiten, von Schleimhaut Impfstoff bis hin zu Biokatalysator, Biosensor, Bioremediation, angezeigt worden oder bioanalytische Tool^8,13.

Vor kurzem wurde ein anderer Ansatz von Spore Display entwickelten¹⁹. Diese zweite System ist nonrecombinant und stützt sich auf die spontane und extrem engen Adsorption der Moleküle auf der Oberfläche Spore-⁹. Antigene^19,20 und Enzyme^13,21 effizient angezeigt worden und haben gezeigt, dass diese Methode ist wesentlich effizienter als die rekombinante. Dieser nonrecombinant Ansatz ermöglicht die Darstellung von Proteinen in gediegener Form²⁰ und kann auch verwendet werden, mit autoklaviert, Tod Sporen¹⁹. Der molekulare Mechanismus der Adsorption ist noch nicht vollständig geklärt. Die negative Ladung und der Hydrophobie der Spore wurden als relevanten Eigenschaften für die Adsorption^13,19,22vorgeschlagen. Vor kurzem hat sich gezeigt, dass ein Modell-Protein, das rote Autofluorescent Protein (mRFP) von den Korallen Discosoma, wenn um die Spore, adsorbiert durch die Lokalisierung in der inneren Schicht²³Oberflächenschichten zu infiltrieren konnte. Wenn auch für andere Proteine nachgewiesen, erklären die internen Lokalisierung der heterologen Proteine ihre erhöhte Stabilität wenn Sporen²³adsorbiert.

In einer aktuellen Studie zwei Enzyme katalysieren zwei aufeinander folgenden Schritten des Xylan-Abbau-Signalwegs waren unabhängig voneinander auf Sporen von B. Subtilis angezeigt und wenn gemeinsam inkubiert wurden beide Abbau Schritte²¹durchführen. Sporen gesammelt, nachdem die Reaktion waren noch aktiv und können weiterhin die Xylan-Abbau auf die Zugabe von frischem Substrat²¹. Selbst wenn ein Verlust von etwa 15 % des Endprodukts in der zweiten Reaktion²¹beobachtet wurde, ist die Wiederverwendbarkeit von adsorbierten Enzyme für einzelne, als auch Multi-Step Reaktionen ein weiterer wichtiger Vorteil der Spore-Display-System.

Pan Et Al.²⁴ berichtete eine weitere Annäherung an heterologen Proteine auf der Oberfläche der Spore anzeigen: heterologe Proteine (ein Endoglucanase Protein und ein Beta-Galaktosidase man) in die Mutterzelle in Sporenbildung erzeugt wurden spontan eingehüllt in den bildenden Spore-Mantel, ohne die Notwendigkeit eines Trägers. Diese zusätzliche Spore-Display-System ist eine Kombination der beiden Ansätze bisher beschriebenen. Tatsächlich ist es rekombinante, da die heterologe Proteine entwickelt wurden, um in der Mutterzelle während der Sporenbildung, ausgedrückt werden, während deren Montage innerhalb der Mantel spontan war und daher nonrecombinant²⁴. Jedoch bleibt die Effizienz der Anzeige dieses zusätzliche Ansatzes getestet und verglichen mit den anderen beiden Ansätzen mithilfe der gleichen heterologen Proteinen.

Dieses Protokoll schließt die Prozesse der Spore Produktion und Reinigung, die wurden ausführlich an anderer Stelle beschrieben²⁴. Freuen Sie sich auf die Adsorption Reaktion, die Bewertung der Effizienz der Adsorption von Dot-Blot und Fluoreszenz-Mikroskopie und rundet das recycling von adsorbierten Enzyme für zusätzliche Reaktion.