Verbesserung der hohen Viskosität Extrusion der Mikrokristalle für zeitaufgelöste serielle Femtosekunden Kristallographie an x-ray Laser

Serielle Femtosekunden Kristallographie (SFX) ist eine strukturelle Biologie-Technik, die die einzigartigen Eigenschaften des Röntgen-freie-Elektronen-Laser (XFEL) auf Raumtemperatur Strukturen bestimmen nutzt aus Tausenden von Mikrometer große Kristalle während schneller als die meisten die Strahlenschäden durch den “Beugung vor Zerstörung” Prinzip^1,2,3.

In einer zeitaufgelösten Verlängerung von SFX (TR-SFX) dienen der Femtosekunden-Impulse aus der XFEL, strukturelle Veränderungen in Proteine^4,5zu studieren. Das Protein des Interesses ist mit einem optischen Laser (oder eine andere Aktivität Trigger) kurz vor dem Schuss von XFEL in einem Pumpe-Sonde-Setup aktiviert. Durch die präzise Steuerung die Verzögerung zwischen Pumpe und Sonde Impulsen, kann das Zielprotein in verschiedenen Staaten erfasst werden. Molekulare Filme von strukturellen Veränderungen über elf Größenordnungen in der Zeit demonstrieren die Macht der neuen XFEL-Quellen, die Dynamik von mehreren Protein Ziele^{6,7,8,9zu studieren, 10,11,12,13}. Grundsätzlich schließt sich die Methode der dynamischen spektroskopischen und statische strukturelle Techniken ineinander, bietet einen Einblick in Proteindynamik am in der Nähe von atomarer Auflösung.

Einfache Systeme für TR-SFX enthalten eine endogene Auslöser der Aktivierung mit einer lichtempfindlichen Komponente wie Retinal in Bakteriorhodopsin (bR)^9,10, die Chromophore in Photosystem II^12,13, photoaktiven gelbe Protein (PYP)^6,7 reversibel photoschaltbare fluoreszierendes Protein¹¹oder eine Photolyzable Kohlenmonoxid in Myoglobin⁸. Spannende Varianten der Technik noch in der Entwicklung setzen auf Mischung und Regelungen^14,15 enzymatischer Reaktionen oder ein elektrisches Feld verwendet, um strukturelle Veränderungen¹⁶induzieren studieren zu injizieren. Angesichts der Tatsache, dass XFEL Quellen nur ein paar Jahre lang zur Verfügung wurden und Erfolge der Vergangenheit in die Zukunft extrapolieren, die Methode potential wie ein richtiges Spiel-Wechsler in Bezug auf unser Verständnis, wie zeigt Proteine Funktion.

Da biologische Proben von einer einzigen Exposition zu einer high-Power-XFEL Puls zerstört werden, wurden neue Ansätze für die Proteinkristallographie notwendig. Die Fähigkeit, große Mengen an einheitliche Mikrokristalle wachsen musste unter diesen Verfahren entwickelten^17,18,19sein. Zur Erfassung der Daten auf einem XFEL zu ermöglichen, müssen diese Kristalle geliefert, verworfen und dann für jede XFEL Puls erneuert. Angesichts der Tatsache, dass XFELs nutzbare Impulse bei 10-120 Hz Feuer, muss Musterlieferung schnell, stabil und zuverlässig, dabei auch die Kristalle intakt und Begrenzung Verbrauch. Unter den erfolgreichsten Lösungen ist ein hohe Viskosität Mikro-Extrusion Injektor, der eine kontinuierlich streaming Spalte Raumtemperatur Kristall-beladenen Lipid-kubische Phase (LCP) über die gepulste Röntgen Strahl²⁰liefert. Zufällig orientierte Kristalle, eingebettet in der LCP-Stream, das sind von der XFEL Impulse Scatter Röntgenstrahlen auf einen Detektor, wo ein Beugungsmuster aufgezeichnet wird, abgefangen. LCP war eine natürliche Wahl für ein Probe-Lieferung-Medium, da es häufig als ein Wachstumsmedium für Membran-Protein Kristalle^17,21,22,23, noch andere hohe Viskosität Trägermedien ^{verwendet wird 24,25,26,27,28,29,30} und lösliche Proteine³¹ auch im Injektor verwendet wurden. SFX mit hoher Viskosität Injektor war erfolgreich bei der Strukturaufklärung von Membran Proteine^13,32 einschließlich G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs)^{33,34, 35,36,37}, mit der Datenqualität für native Phasenabgleich^38,39 dabei Zeit und Probe effizient ausreichend. Derzeit, diese Injektoren werden mehr routinemäßig für Temperatur-Messungen am Synchrotron Quellen^28,30,40,41 sowie während der mehr technisch anspruchsvolle TR-SFX-Experimente am XFELs^9,10,13,42.

Vergleichbare TR-SFX-Experimente wurden durchgeführt mit anderen Injektor-Typen wie Flüssigphase Lieferung in einem Fluss Düse^6,7,12konzentriert, jedoch erfordert diese Methode Protein Mengen nicht verfügbar für viele biologisch interessante Ziele. Zur Bestimmung der statischen Strukturen mit viskosen Extrusion einen durchschnittlichen Verbrauch von 0,072 mg Protein pro 10.000 indizierten Beugungsmuster im Vergleich zu 9,35 mg für Flüssigkeitsstrahls wurden Düsen (d. h. über 130 Mal mehr Probe gemeldet effiziente)²⁰. Die hohe Viskosität-Injektor hat sich gezeigt, eine tragfähige Probe Abgabegerät für TR-SFX zu sein, während nur einige dieser Probe Effizienz⁴³zu opfern. In Nogly Et Al. (2018)¹⁰, z. B. Probe Verbrauch war ca. 1,5 mg pro 10.000 indizierten Muster, die günstig im Vergleich zu ähnlichen TR-SFX-Experimenten mit PYP wo durchschnittliche Probe Verbrauch viel höher bei 74 mg Protein pro 10.000 war indizierte Muster⁶. Hohe Viskosität Injektoren haben somit klare Vorteile, wenn Begrenzung der Höhe des Proteins zur Verfügung oder Kristalle direkt in LCP angebaut werden.

Für TR-SFX mit hoher Viskosität Injektoren den zuverlässigsten Daten liefern mehrere technische Probleme angegangen werden müssen: die Fließgeschwindigkeit muss weiterhin über kritische Mindestwert; die Hit-Rate sollte beibehalten werden, auf einem Niveau, das nicht langsame Datenerfassung dargestellt wird (z. B. mehr als 5 %); und Probe ohne übermäßige Störungen geliefert werden. Im Idealfall werden diese Bedingungen bereits erfüllt lange vor einer geplanten TR-SFX-Experiment zu XFEL Zeit möglichst effizient zu nutzen. Pricipally, können eine Verlangsamung in der LCP-Stream, sondieren Kristalle, die mit mehreren optischen Laserpuls und Ergebnis in gemischten aktive Zustände aktiviert wurden, oder sondieren gepumpte Material, Umpumped Material in den Strahlengang erwartet wird. Ein weiterer Vorteil der Injection Pre-Tests ist, dass Ausfallzeiten während der Datenerfassung in einem XFEL als Zeit verbannt zu ersetzen verstopfte Düsen, ändern sich nicht Extrudieren Proben minimiert und andere Wartungsaufgaben wird reduziert wird.

Hier präsentieren wir Ihnen eine Methode zur Optimierung der Musterlieferung für TR-SFX-Datenerfassung mit einer hohen Viskosität Mikro-Extrusion Injektor. Der Einfachheit halber uns die beschriebenen Methoden verlassen nicht auf Zugriff auf eine Röntgenquelle, obwohl Arbeit bei einem Synchrotron Strahlrohr²⁹ weiter über erwartete Trefferquoten und Kristall Beugung informieren würde. Unsere Protokolle wurden entwickelt, um Experimente zur Netzhaut Isomerisierung in den-Protonenpumpe Bakteriorhodopsin¹⁰ erfassen zu optimieren und erfolgt in zwei Phasen, beginnend mit Kristall Probenvorbereitung für Extrusion, gefolgt von der Überwachung der extrusion verwenden eine High-Speed-Kamera-Setup. In Phase eins wird der Kristall-beladenen LCP mit zusätzlichen LCP, niedrigen Übergang Temperatur Lipide oder andere Zusatzstoffe, um sicherzustellen, dass die endgültige Mischung für die Lieferung in die Probenumgebung geeignet ist, ohne Verstopfung oder Verlangsamung gemischt. Ein neues drei-weg-Spritze-Koppler wurde entwickelt, um die mischenden Leistungsfähigkeit und Probe Homogenität zu verbessern. Die zweite Phase besteht aus einer Extrusion Test aufgezeichnet von einer Hochgeschwindigkeitskamera der Extrusion Drehzahlstabilität direkt zu messen. Nach der Analyse die Videodaten können Anpassungen des Probe-Vorbereitung-Protokolls vorgenommen werden, um experimentelle Ergebnisse zu verbessern. Diese Verfahren können angepasst werden, um andere Proteine für TR-SFX-Datenerhebung, mit minimalen Änderungen vorzubereiten und werden dazu beitragen, die effiziente Nutzung der begrenzten XFEL Strahlzeit. Mit neuen XFEL-Einrichtungen, die gerade erst ihren Betrieb^44,45 und die Übertragung der Injektor-basierte serielle Methoden der Datenerhebung an Synchrotrons^28,30,40,41 , die nächsten Jahre werden sicherlich weiterhin spannende neue Einblicke in die strukturelle Dynamik von ein immer breiteres Spektrum an Protein-Targets.