تحسين قذف لزوجة عالية من ميكروكريستالس لحل وقت المسلسل Femtosecond البلورات في أشعة الليزر

Femtosecond المسلسل علم البلورات (SFX) هو أسلوب الأحياء هيكلية التي يستغل الخواص الفريدة لليزر الإلكترون الحر بالأشعة السينية (إكسفيل) لتحديد درجة حرارة الغرفة هياكل الآلاف من بلورات الحجم ميكرومتر بينما الأمر معظم أضرار الإشعاع “الحيود قبل تدمير” المبدأ^1،2،3.

في ملحق الوقت وتصميما من سفاكس (TR-سفاكس)، تستخدم نبضات femtosecond من إكسفيل لدراسة التغيرات الهيكلية في البروتينات^4،5. يتم تنشيط بروتين اهتمام ليزر ضوئية (أو مشغل النشاط آخر) قبل إصابته برصاص إكسفيل في إعداد تحقيق مضخة. بدقة السيطرة على التأخير بين نبضات المضخة والتحقيق، يمكن التقاط البروتين المستهدفة في مختلف الدول. أفلام الجزيئية للتغييرات الهيكلية على مدى إحدى عشرة من حيث الحجم في وقت تثبت قوة مصادر إكسفيل جديدة لدراسة ديناميات عدة البروتين الأهداف^6،،من^{78،9، 10،11،،}من¹²¹³. أساسا، ينضم الأسلوب التقنيات الهيكلية دينامية الطيفية وثابت واحد، تقديم لمحة في ديناميات البروتين في القرب من القرار الذري.

قد تحتوي على أنظمة بسيطة ل TR-سفاكس مشغل ذاتية للتنشيط مع عنصر الصور الحساسة مثل الشبكية في^9،باكتيريورهودوبسين (bR)¹⁰، صباغات في فوتوسيستيم الثاني^12،13، ^6،فوتواكتيفي البروتين أصفر (PYP)⁷ عكسية فوتوسويتشابل بروتين فلوري¹¹، أو أول أكسيد الكربون فوتوليزابل في الميوجلوبين⁸. الاعتماد على مزيج اختلافات مثيرة من هذه التقنية لا تزال في التنمية وضخ مخططات^14،15 دراسة التفاعلات الانزيمية أو مجال الكهربائي تستخدم للحث على إجراء تغييرات هيكلية¹⁶. نظراً لأن مصادر إكسفيل كانت متاحة فقط لبضع سنوات واستقراء النجاحات السابقة في المستقبل، الأسلوب يبين المحتملة مغير لعبة حقيقية فيما يتعلق بفهمنا لكيفية وظيفة البروتينات.

لأنه يتم تدمير عينات بيولوجية تعرض مرة واحدة لقوة عالية نبض إكسفيل، ونهج جديدة للبروتين البلوري كانت ضرورية. من بين هذه الإجراءات، يلزم أن القدرة على زراعة كميات كبيرة من ميكروكريستالس الموحدة المتقدمة^17،،من¹⁸¹⁹. لتمكين جمع البيانات في إكسفيل، هذه البلورات يجب أن يكون تسليم وتجاهل وتجديد ثم لكل نبض إكسفيل. تسليم العينة نظراً لأن إكسفيلس النار البقول قابلة للاستخدام في 10-120 هرتز، يجب أن تكون سريعة ومستقرة وموثوق بها، مع الحفاظ أيضا البلورات سليمة والحد من الاستهلاك. من بين الحلول الأكثر نجاحا هو حاقن النتوء الصغير لزوجة عالية، التي يسلم continiously الجري العمود من درجة حرارة الغرفة كريستال لادن lipidic مكعب المرحلة (LCP) عبر نبضات الأشعة السينية شعاع²⁰. بلورات المنحى عشوائياً، المضمنة في الدفق نظام الإجراءات الجزائية، التي يتم اعتراضها من قبل مبعثر نبضات إكسفيل الأشعة السينية على جهاز كشف حيث يتم تسجيل نمط حيود. LCP كان خياراً طبيعيا لوسيلة تسليم عينة كما يتم استخدامه كوسيلة نمو كثيرا ما لغشاء بروتين بلورات^{17،21،22،23}، لزوجة عالية أخرى وسائل الإعلام الناقل ^24،25،،من^2627،،من^2829،30 و³¹ من البروتينات القابلة للذوبان كما استخدمت في محقن. سفاكس مع حاقن لزوجة عالية قد نجحت خلال تصميم هيكل غشاء بروتينات^13،32 بما في ذلك^33،ز مستقبلات البروتين-إلى جانب (جبكرس)^{34، 35،،}من³⁶³⁷، مع نوعية البيانات الكافية لإنشاء^38،مراحل³⁹ الأصلية بينما يجري كل الوقت وعينه تتسم بالكفاءة. حاليا، هذه الحقن تستخدم أكثر بشكل روتيني لقياس درجة حرارة الغرفة في السنكروتروني مصادر^28،30،،من⁴⁰⁴¹ وكذلك خلال الأكثر من الناحية الفنية وتطالب تجارب سفاكس TR في إكسفيلس^9،10،،من¹³⁴².

المقارنة TR-سفاكس التجارب قد نفذت باستخدام أنواع حاقن أخرى مثل الطور السائل ركز التسليم في تدفق فوهة^6،،من⁷¹²، ومع ذلك، يتطلب هذا الأسلوب كميات البروتين لا تتوفر للعديد أهداف مثيرة للاهتمام من الناحية البيولوجية. لتحديد هياكل ثابتة باستخدام البثق لزج متوسط استهلاك 0.072 ميلغرام بروتين لأنماط الحيود المفهرسة 10,000 مقارنة بملغ 9.35 ل jet السائل أبلغ فوهات (أي حوالي 130 مرات أكثر من عينة ²⁰من الكفاءة). ثبت حاقن لزوجة عالية يكون جهاز تسليم نماذج قابلة للتطبيق ل TR-سفاكس بينما فقط التضحية ببعض من هذه الكفاءة عينة⁴³. وكان في نوغلي et al. (2018)¹⁰، على سبيل المثال، نموذج استهلاك حوالي 1.5 ملغ في أنماط المفهرسة 10,000، الذي يقارن إيجابيا لتجارب TR-سفاكس مماثلة باستخدام PYP حيث كان استهلاك متوسط عينة أعلى بكثير مع 74 ملغ بروتين كل 000 10 ⁶من أنماط المفهرسة. وهكذا يكون لزوجة عالية عن طريق الحقن مزايا واضحة عندما يتم الحد من كمية البروتين المتاحة أو عندما تزرع البلورات مباشرة في نظام الإجراءات الجزائية.

ل TR-سفاكس لزوجة عالية باستخدام الحقن لإنتاج البيانات الأكثر موثوقية عدة مسائل تقنية تحتاج إلى معالجتها: سرعة تدفق يحتاج إلى البقاء فوق قيمة الحد أدنى الحرج؛ ينبغي الاحتفاظ بضرب المعدل المستوى لا تجعل من جمع البيانات بطيئة (مثلاً، أكبر من 5 في المائة)؛ وقد عينة لتسليمها دون انقطاع المفرط. ومن الناحية المثالية، الفعل استيفاء هذه الشروط قبل وقت طويل من تجربة TR-سفاكس مجدولة لاستخدام الوقت المتاح إكسفيل أكبر قدر ممكن من الكفاءة. بريسيبالي، قد تسمح تباطؤ في تيار LCP السبر البلورات التي تم تنشيطها مع نبض الليزر الضوئية واحد أو أكثر والنتيجة في الدول النشطة مختلطة، أو سبر ضخ المواد عند أومبومبيد المواد المتوقع في الحزمة. فائدة إضافية لحقن قبل الاختبار هو أن التوقف أثناء جمع البيانات في إكسفيل تصغير وقت إنزالها إلى استبدال فوهات مسدودة، تغيير خارج العينات غير القذف، ويتم تقليل مهام الصيانة الأخرى.

نقدم هنا، وسيلة لتحسين تقديم عينة لجمع البيانات سفاكس TR مع حاقن النتوء الصغير لزوجة عالية. للبساطة، الأساليب المذكورة لا تعتمد على إمكانية الوصول إلى مصدر الأشعة سينية، على الرغم من أن العمل في بيمليني السنكروتروني²⁹ تقديم معلومات إضافية عن معدلات ضرب المتوقعة وكريستال الحيود. لدينا البروتوكولات وضعت لتحسين تجارب لالتقاط isomerization الشبكية في مضخة البروتون باكتيريورهودوبسين¹⁰ وتنفذ على مرحلتين بدءاً بإعداد عينات كريستال لقذف متبوعاً بالرصد قذف استخدام إعداد كاميرا عالية السرعة. في المرحلة الأولى، يختلط LCP كريستال لادن LCP إضافية، انتقال انخفاض درجة حرارة الدهون، أو غيرها من المواد المضافة لضمان الخليط النهائي مناسبة لتوصيلها إلى البيئة عينة دون إعاقة أو إبطاء. مقرنة حقنه ثلاثية جديدة وضعت لتحسين خلط التجانس الأداء وعينه. وتتألف المرحلة الثانية اختبار قذف سجلتها كاميرا عالية السرعة لقياس استقرار سرعة قذف مباشرة. وبعد تحليل بيانات الفيديو، يمكن تعديلات على بروتوكول إعداد نموذج لتحسين النتائج التجريبية. هذه الإجراءات يمكن تكييفها لتحضير البروتينات الأخرى لجمع البيانات TR-سفاكس، مع الحد الأدنى من تعديلات، وسوف تسهم في الاستخدام الفعال لمحدودية إكسفيل بيمتيمي. مع مرافق إكسفيل جديدة بدأت للتو على العملية^44،45 ونقل أساليب جمع البيانات التسلسلية حاقن المستندة إلى سينتشروترونس^28،،من^3040،41 ، السنوات القليلة القادمة ستواصل بالتأكيد تقديم رؤى جديدة مثيرة في ديناميات الهيكلية لنطاق أوسع من أي وقت مضى لأهداف البروتين.