基于荧光的感染组织细菌基因调控方法

细菌通过不同表达适应和生存所需的基因来应对环境中不断变化的生理条件和营养状态的变化。例如, 机会性病原体在体型相对较低的地方对体表进行殖民, 而且往往是无害的。然而, 一旦细菌已经穿透物理和化学屏障, 它必须与宿主免疫细胞的反防御和限制营养的可用性¹。例如, 金黄色葡萄球菌在大约三分之一的人口中进行了无症状的殖民, 但也是造成破坏性皮肤和软组织感染、骨髓炎、心内膜炎和菌血^{症 2}的原因。金黄色葡萄球菌作为病原体的成功通常归功于其代谢灵活性, 以及一系列与表面相关和分泌的毒力因子, 使细菌能够逃离血液并在外周组织^{中复制3,4,5}。由于葡萄球菌病引起的宿主死亡是进化的死胡同, 限制了对新宿主⁶的传播, 因此必须谨慎控制对毒力因子生产的承诺。

一个复杂的蛋白质调节网络和非编码 rna 响应各种环境刺激, 包括细胞密度、生长阶段、中性粒细胞相关因素和营养物质的供应, 以确保毒力基因在宿主组织内的精确时间和位置^{7、8、9、10}、^11、12、13.例如, SaeR/S 双组分系统 (tcs) 通过传感器激酶 (saes) 和响应调节器 (saer)¹⁴调节几个毒力因子的表达。sais 是在保守的组氨酸残留物上自动磷酸化的, 以响应宿主信号 (例如,人类中性粒细胞肽 (hnps)^{, 钙}儿热锡) 8^,15,16。然后将磷基转移到 sael 上的天冬氨酸残渣中, 将其激活为 dna 结合蛋白 (saer ~ p)¹⁷。SaeR/S tcs 调节20多个基因, 这些基因有助于其发病机制, 包括纤维连接蛋白结合蛋白 (FnBPs)、白细胞介素和凝血酶^{14、18、19、20.}目标可分为高亲和力和低亲和力基因靶标, 当暴露在线索²¹下, 随着 saer ~ p 水平的升高, 很可能会诱发高亲和力和低亲和力基因靶标。SaeR/S 活性由基因表达的其他调节剂控制, 如 agr 仲裁传感系统、毒素蛋白抑制剂 (rot) 和替代西格玛因子 b (sigma)^{22、23、24.}

nuc是金黄色葡萄球菌中的一种与 sae 依赖的毒力基因, 并编码了热尿 (nk), 这对于从顺性疾病和细胞t (net) 中的逃逸和传播是必不可少的。感染过程^25,26。在支链氨基酸和 gtp²⁷存在的情况下, cody也会强烈地抑制血指的表达, 而葡萄球菌辅助调节剂蛋白 sara28^,29 直接抑制着共色的表达., 其活性受氧气 (氧化还原状态) 和 ph 值30的^影响.鉴于在小鼠感染模型中, sae和cc突变体被衰减, 因此有兴趣开发抑制其相应活动的化学干预措施^26、31。尽管如此, 没有关于他们在感染期间的监管的信息。

荧光记者已被用来监测和量化单个细胞水平上的基因表达。在此, 我们提出了一种量化s的方法。金黄色葡萄球菌在感染过程中的基因表达, 当与体外转录组分析和强大的成像技术, 如磁共振成像 (mri) 和磁共振波谱 (mrs), 可以揭示细菌如何生理在体内调节, 而营养物质在某些位位中的相对丰度。该方法可应用于任何具有可追踪遗传系统的细菌病原体。

基因组整合载体概述。

基因组整合载体 prb4 包含来自金黄色葡萄球菌 300 SAUSA300_0087 伪基因上游和下游区域的 500个碱基对, 以促进同源重组。prb4 来源于对温度敏感的 pmad 载体主干, 其中含有红霉素耐药盒 (ermc) 和热稳定性β-半乳糖苷酶基因bgaB , 用于重组剂^的蓝白筛选32。工程记者结构还包含一个氯霉素耐药标记 (猫) 选择后基因组整合和质粒消除, 以及 ecri 和 smai 网站融合监管区域感兴趣的超级文件夹绿色荧光蛋白 (sgfp) (图 1)。人们知道核糖体结合位点 (rbs) 的选择会影响记者的活动, 往往需要经验优化³³。因此, 不提供苏格兰皇家银行。在这里, 本地核糖体结合位点被用来提供更自然的基因表达模式, 但其他位点可能会被使用。