الموصوفة هنا أسلوب لتحليل تعبير الجينات البكتيرية في الأنسجة الحيوانية على مستوى خلوي. هذا الأسلوب يوفر موردا لدراسة التنوع المظهرية التي تحدث داخل سكان بكتيرية في الاستجابة للبيئة الأنسجة أثناء عدوى.
وكثيراً ما ينظم الجينات الفوعة الجرثومية على المستوى النسخي العوامل المتعددة التي تستجيب لإشارات بيئية مختلفة. وتعمل بعض العوامل مباشرة على الجينات الفوعة؛ الآخرين السيطرة المرضية عن طريق ضبط التعبير عن المنظمين المصب أو تراكم الإشارات التي تؤثر على نشاط منظم. في حين درست التنظيم على نطاق واسع من خلال النمو في المختبر ، يعرف سوى القليل نسبيا هو حول كيف يتم تعديل التعبير الجيني أثناء الإصابة. هذه المعلومات المهم عند منتج معين جينات مرشح للتدخل العلاجي. مثل النهج النسخي RT-PCR الكمي، في الوقت الحقيقي وتسلسل الحمض النووي الريبي وسائل قوية لدراسة التعبير الجيني على مستوى عالمي، لكنها تعاني من العديد من التحديات التقنية بما في ذلك وفرة منخفضة من الحمض النووي الريبي البكتيرية بالمقارنة مع المضيف الجيش الملكي النيبالي، وعينه تدهور قبل رنسيس. تقييم تنظيم استخدام الصحفيين الفلورسنت سهلة نسبيا، ويمكن أن يكون متعدد مع البروتينات الفلورية مع الخواص الطيفية فريدة من نوعها. الأسلوب يسمح لتحليل التعبير الجيني في الأنسجة التي تظهر التدرجات العمارة والفيزيائية ثلاثية الأبعاد المعقدة التي تؤثر على الشبكات التنظيمية البكتيرية وحيدة الخلية، والزمانية المكانية. هذه المعلومات يتم فقدان عندما يتم حساب متوسط البيانات على معظم السكان. وهنا، يصف لنا طريقة للتحديد الكمي للتعبير الجيني في مسببات الأمراض البكتيرية في الموقع. الأسلوب الذي يستند إلى تجهيز الأنسجة البسيطة والملاحظة المباشرة من الأسفار من البروتينات مراسل. نبدي بفائدة هذا النظام بدراسة التعبير عن المكوّرات العنقودية الذهبية ثيرمونوكليسي (نشاط)، منتج الجين الذي مطلوب للتهرب من الحصانة وضراوة كامل السابقين فيفو والمجراه. ونحن تبين أن نشاط التجارة والنقل هو المعرب عنها بقوة في الخراجات الكلوية وتكشف عن التعبير الجيني غير متجانسة الواجبة في الجزء الظاهر التنظيم المكاني نشاط المروج النشاط في الخراجات منخرطة تماما مع الاستجابة المناعية. يمكن تطبيق الأسلوب لأي جرثومة مع نظام وراثية مانيبولاتابل وأي نموذج العدوى، وتوفير معلومات قيمة للدراسات الإكلينيكية وتطوير العقاقير.
البكتيريا تستجيب لتغيير الظروف الفسيولوجية والتغيرات في الحالة التغذوية لبيئتهم بخلطات التعبير عن الجينات اللازمة للتكيف والبقاء على قيد الحياة. على سبيل المثال، استعمار مسببات الأمراض الانتهازية الجسم السطوح في نسبيا منخفضة الكثافة، وغالباً ما تكون غير مؤذية. ومع ذلك، مجرد البكتيريا قد اخترقت الحواجز المادية والكيميائية، يجب أن يتعامل مع المضيف المناعي خلية مكافحة الدفاعات وتقييد توافر المغذيات1. على سبيل مثال، المكوّرات العنقودية الذهبية كولونيزيس حوالي ثلث السكان أعراض ولكن أيضا قضية المدمرة الجلد والتهابات الأنسجة الرخوة والتهاب العظم والنقي والتهاب الشغاف وتجرثم2. ويعزى النجاح في المذهبة س. كمسببات المرض غالباً ما المرونة الأيضية، فضلا عن ترسانة من عوامل الفوعة المرتبطة بالسطح ويفرزها تمكن البكتيريا الهروب مجرى الدم وتكرار في الأنسجة المحيطة 34،،5. لأن المضيف الموت بسبب المرض العنقوديات هو مسدود التطورية ونقل حدود ل المضيفين الجديدة6، يجب أن تسيطر الالتزام بإنتاج عامل الفوعة بعناية.
شبكة تنظيمية معقدة من البروتينات والكشف غير الترميز يستجيب لمجموعة متنوعة من المحفزات البيئية، بما في ذلك الخلية كثافة ومرحلة النمو والعوامل المرتبطة العَدلات، وتوافر المغذيات، لضمان أن يتم التعبير عن الجينات الفوعة في دقة الوقت والمكان داخل المضيف الأنسجة7،8،9،10،11،،من1213. على سبيل المثال، ينظم النظام مركبين ساير/S (TCS) التعبير عن عدة عوامل الفوعة عبر كيناز الاستشعار (سايس) و رد منظم (ساير)14. سايس أوتوفوسفوريلاتيد على بقايا الحامض الأميني مصانة في استجابة للمضيف إشارات (مثل، البشرية العَدلات الببتيدات [هنبس]، كالبروتيكتين)8،،من1516. مجموعة فوسفوريل ثم نقل إلى بقايا اسبارتاتي على ساير، تفعيل ذلك بروتين الحمض النووي ملزم (ساير ~ ف)17. وينظم TCS ساير/S ما يزيد على 20 من الجينات التي تساهم في الآلية المرضية بما في ذلك فيبرونيكتين ملزم البروتينات (فنببس)، ليوكوسيدينس، والمخثره14،18،،من1920. ويمكن تصنيف الأهداف إلى الجينات تقارب عالية ومنخفضة-تقارب الأهداف، التي من المحتمل الناجم عن مستوى ساير ~ ف يرتفع عندما تتعرض لما العظة21. ويسيطر النشاط ساير/S الأخرى المنظمين للتعبير الجيني مثل نظام الاستشعار عن النصاب الزراعية، قامع السموم البروتين (Rot)، وبديلة سيغما عامل ب (سيجب)22،،من2324.
نشاط هو جينات فوعة تعتمد على ش في المكوّرات العنقودية الذهبية وترميز ثيرمونوكليسي (نشاط)، الذي أمر ضروري للهروب من نيوتروفيليك هإكستراسيلولار ربرامج العمل الإقليمية (شبكات) ونشر خلال دورة العدوى،من25إلى26. تعبير عن نشاط القمع أيضا بشدة شكل غير مباشر بواسطة كودي حضور الأحماض الأمينية متفرعة السلسلة وأنشئ27، ومباشرة للقمع بالبروتين منظم التبعي العنقوديات سارة28،29 ، يتأثر نشاطها بالأكسجين (حالة الأكسدة) ودرجة الحموضة30. نظراً لأن يتم تخفيف طفرات ساي و نشاط في نماذج الماوس للعدوى، هناك اهتمام بتطوير التدخلات الكيميائية التي تمنع تلك الأنشطة المقابلة26،31. وبالرغم من ذلك، لا توجد معلومات بشأن تنظيمها أثناء الإصابة.
وقد استخدمت الفلورسنت الصحفيين لرصد وقياس التعبير الجيني على مستوى الخلية الواحدة. وهنا، نقدم طريقة لقياس S. التعبير الجيني في المذهبة أثناء الإصابة، عندما يقترن الترنسكربيتوم في المختبر تحليل وقوية تقنيات التصوير مثل التصوير بالرنين المغناطيسي (التصوير بالرنين المغناطيسي)، والتحليل الطيفي الرنين المغناطيسي (السيدة)، يمكن أن تكشف عن كيف البكتيرية وينظم علم وظائف الأعضاء في فيفو ووفرة نسبية من المواد الغذائية في بعض المنافذ. يمكن تطبيق الأسلوب لأي مسببات الأمراض البكتيرية مع نظام وراثية أصعب.
نظرة عامة على ناقل الجينوم التكاملية.
PRB4 ناقلات التكاملية الجينوم يحتوي على 500 قاعدة أزواج كل من مناطق بسيودوجيني S. aureus USA300 SAUSA300_0087 لتسهيل جزئ مثلى المنبع والمصب. pRB4 مشتق من العمود الفقري ناقل بماد حساسة لدرجة الحرارة التي تتضمن الاريثروميسين المقاومة كاسيت (ارمك) والحرارة بيتا-جالاكتوسيداسي جين بجاب لفحص أبيض وأزرق من ريكومبينانتس32. بناء هندسيا مراسل يحتوي أيضا على علامة مقاومة كلورامفينيكول (لجنة مناهضة التعذيب) للتحديد بعد دمج الجينوم والقضاء بلازميد، فضلا عن مواقع اكوري وسماي فتيل المنطقة التنظيمية التي تهم الأخضر سوبيرفولدير الفلورسنت البروتين (سجفب) (الشكل 1). ومن المعروف أن اختيار موقع الربط الريبوسوم (RBS) يؤثر على نشاط المراسل، وغالباً ما يتطلب التحسين التجريبية33. وهكذا، لم يتم توفير RBS. هنا، يستخدم الموقع ملزم الريبوسوم الأصلية لتوفير لنمط أكثر طبيعية من التعبير الجيني، ولكن يمكن أن تستخدم في مواقع أخرى.
الأمراض المعدية البكتيرية مشكلة صحية متزايدة في جميع أنحاء العالم بسبب الحصول على مقاومة المضادات الحيوية محددات46. لأن التكيف مع البيئات المضيف أمر ضروري للنمو والبقاء على قيد الحياة خلال العدوى، استراتيجيات تستهدف البرامج تعبير الجينات التي تزيد من اللياقة البدنية الممرض…
The authors have nothing to disclose.
ونحن نشكر ألكسندر هورسويل لهدية فsarAP1-تدتوماتو الانصهار، وكريسويل كارين للمساعدة في تحليل التدفق الخلوي. ونشكر أيضا الملك أليسا لإسداء المشورة بشأن التحليل الإحصائي. تم تمويل هذا العمل جزئيا “تحكيم البحث” الاستكشافي/الخلقية المعاهد الوطنية للصحة (منحة AI123708) وكلية أموال بدء التشغيل إلى SRB. وكان الممولين أي دور في تصميم الدراسة أو جمع البيانات وتفسير أو مقرر أن يقدم عمل للنشر.
5% sheep blood | Hardy Diagnostics (Santa Maria, CA) | A10 | |
5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-Gal) | ThermoScientific | R0402 | |
Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760-25 | |
C57Bl/6 Mice | Charles River | NA | |
Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C-0378 | |
confocal laser scanning microscope | Zeiss | NA | |
cryostat microtome | Thermo Scientific | NA | |
Culture, Cap | VWR International | 2005-02512 | |
D+2:25NA Oligo | Integrated DNA Technologies (Coralville, Iowa) | NA | |
DNA Ligase | New England Biolabs | M0202S | |
Erythromycin | Sigma-Aldrich | E5389 | |
Flow Analyzer | Becton Dickinson | NA | |
glass beads | Sigma | Z273627 | |
Miniprep, plasmid | Promega | A1220 | |
orbital shaking water bath | New Brunswick Innova | NA | |
PCR purification | QIagen | 28106 | |
Phosphate Buffer Saline (PBS) | Cellgrow | 46-013-CM | |
Plate reader | Tecan | NA | |
Precellys 24 homogenizer | Bertin Laboratories | NA | |
pUC57-Kan | GenScript (Piscataway, NJ) | NA | |
Q5 Taq DNA Polymerase | New England Biolabs (Ipswich, MA) | M0491S | |
Restriction Enzymes | New England Biolabs (Ipswich, MA) | R0150S (PvuI), R3136S (BamHI), R0144S (BglII), R3131S (NheI), R0101S (EcoRI), R0141S (SmaI). | |
Reverse transcriptase | New England BioLabs | E6300L | |
Sanger Sequencing | Genewiz (Germantown, MD) | NA | |
Sub Xero clear tissue freezing medium | Mercedes Medical | MER5000 | |
Superfrost Plus microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
superloop | GE Lifesciences | 18111382 | |
Syringe, Filter | VWR International | 28145-481 | |
Syto 40 | Thermo Fisher Scientific | S11351 | Membrane permeant nucleic acid stain |
Tetracycline | Sigma-Aldrich | T7660 | |
Tryptic Soy Broth | VWR | 90000-376 | |
UV-visible spectrophotometer | Beckman Coulter-DU350 | NA | |
Vectashield Antifade Mounting medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1500 |