Summary

Uso en transferencia de energía de resonancia de la fluorescencia de Vitro para el estudio de la dinámica de los complejos de la proteína en una escala de tiempo de milisegundos

Published: March 14, 2019
doi:

Summary

Las interacciones proteína-proteína son críticas para los sistemas biológicos, y estudios de la cinética de Unión proporcionan penetraciones en la dinámica y función de complejos de la proteína. Se describe un método que cuantifica los parámetros cinéticos de una proteína compleja mediante la transferencia de energía de resonancia de la fluorescencia y la técnica de flujo detenido.

Abstract

Las proteínas son los principales operadores de los sistemas biológicos, y generalmente interactúan con otros macro o pequeñas moléculas para llevar a cabo sus funciones biológicas. Estas interacciones pueden ser altamente dinámicas, lo que significa las subunidades interactúan constantemente asociadas y disociadas en determinados tipos. Medir la afinidad usando técnicas tales como desplegable cuantitativa revela la fuerza de la interacción, estudiando la cinética de Unión proporciona penetraciones en cómo rápidamente se produce la interacción y cuánto tiempo puede existir cada complejo. Además, medir la cinética de la interacción en presencia de un factor adicional, como un factor de intercambio de proteínas o una droga, ayuda a revelar el mecanismo por el cual la interacción está regulada por el factor conocimiento importante para la avance de la investigación biológica y médica. Aquí, describimos un protocolo para la medición de la cinética de unión de una proteína compleja que tiene una tasa alta asociación intrínseca y puede disociarse rápidamente por otra proteína. El método utiliza la transferencia de energía de resonancia de la fluorescencia para divulgar la formación del complejo de la proteína in vitro, y permite la rápida asociación y disociación del complejo en tiempo real en un Fluorímetro de flujo detenido. Usando este análisis, se cuantifican las constantes de tarifa de asociación y disociación de la proteína del complejo.

Introduction

En última instancia se llevan a cabo actividades biológicas de proteínas, más que interactuar con otros para las funciones biológicas apropiadas. Usando un enfoque computacional, el importe total de las interacciones proteína-proteína en humanos se estima que 650.000 ~1, y la interrupción de estas interacciones a menudo conduce a enfermedades2. Debido a su papel esencial en el control de procesos celulares y organismos, se han desarrollado numerosos métodos para estudiar interacciones de proteínas, tales como levadura dos-híbrido, complementación bimolecular de la fluorescencia, split-luciferase complementación y co-inmunoprecipitación ensayo3. Mientras que estos métodos son buenos para descubrir y confirmar las interacciones proteína-proteína, son generalmente no-cuantitativos y así proporcionar información limitada sobre la afinidad entre los socios de proteínas interactuantes. Cuantitativas desplegables pueden utilizarse para medir la afinidad de unión (por ejemplo, la constante de disociación Kd), pero no mide la cinética de la Unión, ni se puede aplicar cuando el Kd es muy baja debido a una inadecuada relación señal a ruido4. Espectroscopia de la resonancia (SPR) de plasmón superficial cuantifica la cinética de Unión, pero se requiere una superficie específica y la inmovilización de un reactivo en la superficie, que puede potencialmente cambiar la propiedad de la fijación del reactivo5. Por otra parte, es difícil para el SPR medir rápida asociación y disociación tarifas5y no es apropiado utilizar SPR para caracterizar el evento de intercambio de subunidades de la proteína en un complejo proteico. Aquí, describimos un método que permite medir las tasas de proteínas complejo montaje y desmontaje en una escala de tiempo de milisegundos. Este método era fundamental para determinar el papel de Cullin –unsociado –Nedd8 –dissociated proteína 1 (Cand1) como el F-box proteína exchange factor6,7.

Cand1 regula la dinámica de Skp1•Cul1•F-caja proteina (SCF) E3 ligasas, que pertenecen a la gran familia de ligasas de ubiquitina Cullin-anillo. Contratando consiste en el cullin Cul1, que une a la proteína de dominio de anillo Rbx1, y una proteína F-box intercambiable, que recluta a los sustratos y se une Cul1 a través de la proteína adaptador Skp18. Como una ligasa E3, SCF cataliza la conjugación de ubiquitina a su sustrato, y se activa cuando el sustrato es reclutado por la proteína F-box, y cuando Cul1 es modificado por la proteína ubiquitina-como Nedd89. Cand1 se une Cul1 sin modificar, y en Unión, altera tanto la Asociación de la proteína Skp1•F-caja con Cul1 y la conjugación de Nedd8 Cul110,11,12,13. Como resultado, Cand1 parece ser un inhibidor de la actividad SCF in vitro, pero la deficiencia de Cand1 en organismos causó defectos que sugiere un papel positivo de Cand1 en la regulación de las actividades SCF en vivo14,15,16 , 17. esta paradoja fue finalmente explicada por un estudio cuantitativo que reveló las interacciones dinámicas entre proteína Cul1, Cand1 y caja de Skp1•F. Usando análisis de transferencia (traste) de energía de resonancia de la fluorescencia que detectan la formación de los complejos SCF y Cul1•Cand1, la asociación y disociación tasa constantes (kel y kfuera, respectivamente) fueron medido individualmente. Las mediciones revelaron que Cand1 y caja de Skp1•F forma muy apretado complejo proteico con Cul1 pero el kfuera de SCF es aumentado por Cand1 y el kfuera de Cul1•Cand1 es aumentado por proteínas de Skp1•F-caja de6,7. Estos resultados proporcionan la ayuda inicial y fundamental para definir el papel de Cand1 como un factor de intercambio de proteína, que cataliza la formación de nuevos complejos SCF a través del reciclaje Cul1 de los viejos complejos SCF.

Aquí, presentamos el procedimiento de desarrollar y utilizar el ensayo de traste para estudiar la dinámica de los complejos de Cul1•Cand17, y el mismo principio puede aplicarse para estudiar la dinámica de diversas biomoléculas. TRASTE se produce cuando un donante está entusiasmado con la longitud de onda adecuada, y con el espectro de excitación superposición el espectro de emisión del donador aceptor está presente dentro de una distancia de 10-100 Å. El estado excitado se transfiere al aceptador, de tal modo disminuyendo la intensidad de donantes y aumentar la intensidad aceptador del18. La eficacia de traste (E) depende del radio de Förster (R0) y la distancia entre el donador y aceptor fluoróforos (r) y está definida por: E = R06/ (R0 6 + r6). El radio de Förster (R0) depende de algunos factores, incluyendo la orientación angular del dipolo, la superposición espectral de la pareja donante-receptor y la solución utilizada19. Para aplicar el ensayo de traste en un Fluorímetro de flujo detenido, que supervisa el cambio de la emisión del donador en tiempo real y permite medidas de rápida kel y kfuera, es necesario establecer eficiente traste que resultados en una reducción significativa de emisiones de donantes. Por lo tanto, diseño eficiente traste seleccionando el par apropiado de tintes fluorescentes y los sitios de las proteínas de la blanco para fijar los tintes es importante y se discutirá en el presente Protocolo.

Protocol

1. diseño del ensayo de traste. Descargar el archivo de estructura de la Cul1•Cand1 complejo de Protein Data Bank (archivo 1U6G). Ver la estructura de la Cul1•Cand1 complejo en PyMOL. Utilice la función de medición bajo el menú Asistente de PyMOL para estimar la distancia entre el primer aminoácido de Cand1 y el último aminoácido de Cul1 (figura 1). El visor de espectros en línea de carga (véase Ta…

Representative Results

Para probar el traste entre Cul1AMC y Cand1 FlAsH, primero determinamos la intensidad de emisión de 70 nM Cul1AMC (el donante) y 70 nM Cand1 FlAsH(el aceptador), respectivamente (Figura 3A-C, azul líneas). En cada análisis, solamente un pico de emisión era presente y la emisión de Cand1 FlAsH(el aceptador) fue bajo. Cuando 70 nM de Cul1AMC y destelloCand1 se mez…

Discussion

TRASTE es un fenómeno físico que es de gran interés para el estudio y comprensión de los sistemas biológicos19. Aquí, presentamos un protocolo para probar y usar trastes para estudiar la cinética de unión de dos proteínas interactuantes. Al diseñar el traste, se consideraron tres factores principales: el solapamiento espectral entre donantes emisión y aceptador de la excitación, la distancia entre los dos fluoróforos y la orientación del dipolo de los fluoróforos28…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos a Ou Shu Shan (California Institute of Technology) perspicaz discusión sobre el desarrollo de la prueba de traste. M.G., Y.Z. y los X.L. fueron financiados por fondos de inicio de la Universidad de Purdue a Y.Z. y X.L.This trabajo fue apoyado en parte por una subvención de semillas del centro de la Universidad de Purdue para Biología de plantas.

Materials

Anion exchange chromatography column GE Healthcare 17505301 HiTrap Q FF anion exchange chromatography column
Benchtop refrigerated centrifuge Eppendorf 2231000511
BL21 (DE3) Competent Cells ThermoFisher Scientific C600003
Calcium Chloride Fisher Scientific C78-500
Cation exchange chromatography column GE Healthcare 17505401 HiTrap SP Sepharose FF
Desalting Column GE Healthcare 17085101
Floor model centrifuge (high speed) Beckman Coulter J2-MC
Floor model centrifuge (low speed) Beckman Coulter J6-MI
Fluorescence SpectraViewer ThermoFisher Scientific https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cell-analysis/labeling-chemistry/fluorescence-spectraviewer.html
FluoroMax fluorimeter HORIBA FluoroMax-3
FPLC GE Healthcare 29018224
GGGGAMC peptide New England Peptide custom synthesis
Glutathione beads GE Healthcare 17075605
Glycerol Fisher Scientific G33-500
HEPES Fisher Scientific BP310-100
Isopropyl-β-D-thiogalactoside (IPTG) Fisher Scientific 15-529-019
LB Broth Fisher Scientific BP1426-500
Ni-NTA agarose Qiagen 30210
Ovalbumin MilliporeSigma A2512
pGEX-4T-2 vector GE Healthcare 28954550
Protease inhibitor cocktail MilliporeSigma 4693132001
Reduced glutathione Fisher Scientific BP25211
Refrigerated shaker Eppendorf M1282-0004
Rosetta Competent Cells MilliporeSigma 70953-3
Size exclusion chromatography column GE Healthcare 28990944 Superdex 200 10/300 GL column
Sodium Chloride (NaCl) Fisher Scientific S271-500
Stopped-flow fluorimeter Hi-Tech Scientific SF-61 DX2
TCEP·HCl Fisher Scientific PI20490
Thrombin MilliporeSigma T4648
Tris Base Fisher Scientific BP152-500
Ultrafiltration membrane MilliporeSigma UFC903008 Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units, Ultra-15, 30,000 NMWL

References

  1. Stumpf, M. P. H., et al. Estimating the size of the human interactome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (19), 6959-6964 (2008).
  2. Kuzmanov, U., Emili, A. Protein-protein interaction networks: probing disease mechanisms using model systems. Genome Medicine. 5 (4), 37 (2013).
  3. Titeca, K., Lemmens, I., Tavernier, J., Eyckerman, S. Discovering cellular protein-protein interactions: Technological strategies and opportunities. Mass Spectrometry Reviews. , 1-33 (2018).
  4. Lapetina, S., Gil-Henn, H. A guide to simple, direct, and quantitative in vitro binding assays. Journal of Biological Methods. 4 (1), 62 (2017).
  5. Zheng, X., Bi, C., Li, Z., Podariu, M., Hage, D. S. Analytical methods for kinetic studies of biological interactions: A review. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 113, 163-180 (2015).
  6. Pierce, N. W., et al. Cand1 promotes assembly of new SCF complexes through dynamic exchange of F box proteins. Cell. 153 (1), 206-215 (2013).
  7. Liu, X., Reitsma, J. M., Mamrosh, J. L., Zhang, Y., Straube, R., Deshaies, R. J. Cand1-Mediated Adaptive Exchange Mechanism Enables Variation in F-Box Protein Expression. Molecular Cell. 69 (5), 773-786 (2018).
  8. Zheng, N., et al. Structure of the Cul1-Rbx1-Skp1-F boxSkp2 SCF ubiquitin ligase complex. Nature. 416 (6882), 703-709 (2002).
  9. Kleiger, G., Deshaies, R. Tag Team Ubiquitin Ligases. Cell. 166 (5), 1080-1081 (2016).
  10. Zheng, J., et al. CAND1 binds to unneddylated CUL1 and regulates the formation of SCF ubiquitin E3 ligase complex. Molecular Cell. 10 (6), 1519-1526 (2002).
  11. Hwang, J. W., Min, K. W., Tamura, T. A., Yoon, J. B. TIP120A associates with unneddylated cullin 1 and regulates its neddylation. FEBS Letters. 541 (1-3), 102-108 (2003).
  12. Min, K. W., Hwang, J. W., Lee, J. S., Park, Y., Tamura, T., Yoon, J. B. TIP120A associates with cullins and modulates ubiquitin ligase activity. Journal of Biological Chemistry. 278 (18), 15905-15910 (2003).
  13. Goldenberg, S. J., et al. Structure of the Cand1-Cul1-Roc1 complex reveals regulatory mechanisms for the assembly of the multisubunit cullin-dependent ubiquitin ligases. Cell. 119 (4), 517-528 (2004).
  14. Chuang, H. W., Zhang, W., Gray, W. M. Arabidopsis ETA2, an apparent ortholog of the human cullin-interacting protein CAND1, is required for auxin responses mediated by the SCF(TIR1) ubiquitin ligase. Plant Cell. 16 (7), 1883-1897 (2004).
  15. Feng, S., et al. Arabidopsis CAND1, an Unmodified CUL1-Interacting Protein, Is Involved in Multiple Developmental Pathways Controlled by Ubiquitin/Proteasome-Mediated Protein Degradation. the Plant Cell Online. 16 (7), 1870-1882 (2004).
  16. Cheng, Y., Dai, X., Zhao, Y. AtCAND1, a HEAT-repeat protein that participates in auxin signaling in Arabidopsis. Plant Physiology. 135 (June), 1020-1026 (2004).
  17. Lo, S. -. C., Hannink, M. CAND1-Mediated Substrate Adaptor Recycling Is Required for Efficient Repression of Nrf2 by Keap1. Molecular and Cellular Biology. 26 (4), 1235-1244 (2006).
  18. Okamoto, K., Sako, Y. Recent advances in FRET for the study of protein interactions and dynamics. Current Opinion in Structural Biology. 46, 16-23 (2017).
  19. Hussain, S. A. An introduction to fluorescence resonance energy transfer (FRET). arXiv preprint. , (2009).
  20. Li, T., Pavletich, N. P., Schulman, B. A., Zheng, N. High-level expression and purification of recombinant SCF ubiquitin ligases. Methods in Enzymology. 398 (1996), 125-142 (2005).
  21. Popp, M. W., Antos, J. M., Grotenbreg, G. M., Spooner, E., Ploegh, H. L. Sortagging: A versatile method for protein labeling. Nature Chemical Biology. 3 (11), 707-708 (2007).
  22. Antos, J. M., Ingram, J., Fang, T., Pishesha, N., Truttmann, M. C., Ploegh, H. L. Site-Specific Protein Labeling via Sortase-Mediated Transpeptidation. Current Protocols in Protein Science. 89, (2017).
  23. Froger, A., Hall, J. E. Transformation of Plasmid DNA into E. coli Using the Heat Shock Method. Journal of Visualized Experiments. , (2007).
  24. Simpson, R. J. SDS-PAGE of Proteins. Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), (2006).
  25. Kleiger, G., Saha, A., Lewis, S., Kuhlman, B., Deshaies, R. J. Rapid E2-E3 Assembly and Disassembly Enable Processive Ubiquitylation of Cullin-RING Ubiquitin Ligase Substrates. Cell. 139 (5), 957-968 (2009).
  26. Biro, F. N., Zhai, J., Doucette, C. W., Hingorani, M. M. Application of Stopped-flow Kinetics Methods to Investigate the Mechanism of Action of a DNA Repair Protein. Journal of Visualized Experiments. (37), 2-8 (2010).
  27. Patel, J. T., Belsham, H. R., Rathbone, A. J., Friel, C. T. Use of Stopped-Flow Fluorescence and Labeled Nucleotides to Analyze the ATP Turnover Cycle of Kinesins. Journal of Visualized Experiments. (92), 1-6 (2014).
  28. Bajar, B. T., Wang, E. S., Zhang, S., Lin, M. Z., Chu, J. A guide to fluorescent protein FRET pairs. Sensors (Switzerland). 16 (9), 1-24 (2016).
  29. Chen, A. K., Cheng, Z., Behlke, M. A., Tsourkas, A. Assessing the sensitivity of commercially available fluorophores to the intracellular environment. Analytical Chemistry. 80 (19), 7437-7444 (2008).
  30. Lin, C. T., Rorabacher, D. B. Mathematical approach for stopped-flow kinetics of fast second-order reactions involving inhomogeneity in the reaction cell. Journal of Physical Chemistry. 78 (3), 305-308 (1974).
  31. Toseland, C. P., Geeves, M. A. Rapid Reaction Kinetic Techniques. Fluorescent Methods for Molecular Motors. , 49-65 (2014).
  32. Adams, S. R., et al. New biarsenical ligands and tetracysteine motifs for protein labeling in vitro and in vivo: Synthesis and biological applications. Journal of the American Chemical Society. 124 (21), 6063-6076 (2002).
  33. Lin, C. W., Ting, A. Y. Transglutaminase-catalyzed site-specific conjugation of small-molecule probes to proteins in vitro and on the surface of living cells. Journal of the American Chemical Society. 128 (14), 4542-4543 (2006).
  34. Yin, J., et al. Genetically encoded short peptide tag for versatile protein labeling by Sfp phosphopantetheinyl transferase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (44), 15815-15820 (2005).
  35. Diaspro, A., Chirico, G., Usai, C., Ramoino, P., Dobrucki, J. Photobleaching. Handbook Of Biological Confocal Microscopy. , 690-702 (2006).
  36. Aoki, K., Kamioka, Y., Matsuda, M. Fluorescence resonance energy transfer imaging of cell signaling from in vitro to in vivo: Basis of biosensor construction, live imaging, and image processing. Development, Growth & Differentiation. 55 (4), 515-522 (2013).
  37. Kilic, S., et al. Single-molecule FRET reveals multiscale chromatin dynamics modulated by HP1α. Nature Communications. 9 (1), (2018).
  38. Shen, K., Arslan, S., Akopian, D., Ha, T., Shan, S. O. Activated GTPase movement on an RNA scaffold drives co-translational protein targeting. Nature. 492 (7428), 271-275 (2012).
  39. Bajar, B. T., et al. Improving brightness and photostability of green and red fluorescent proteins for live cell imaging and FRET reporting. Scientific Reports. 6 (February), 1-12 (2016).

Play Video

Cite This Article
Garsamo, M., Zhou, Y., Liu, X. Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale. J. Vis. Exp. (145), e59038, doi:10.3791/59038 (2019).

View Video