Protein-protein interaksjoner er avgjørende for biologiske systemer, og studier av bindende kinetics gir innsikt i dynamikk og funksjonen av protein komplekser. Vi beskriver en metode som quantifies kinetic parameterne for et protein kompleks fluorescens resonans energioverføring og stoppet-flow teknikken.
Proteiner er primære operatører av biologiske systemer, og de kommuniserer vanligvis med andre makro- eller små molekyler utføre sine biologiske funksjoner. Slike samhandlinger kan være svært dynamisk, betyr de samspill underenheter er stadig forbundet og avstand på enkelte priser. Mens måle forpliktende tilhørighet med teknikker som kvantitative rullegardinmenyen avslører styrke samhandling, studere bindende kinetics gir innsikt i hvordan rask samspillet skjer og hvor lenge hver komplekset finnes. Videre måle the kinetics av en interaksjon i nærvær av en tilleggsfaktor, for eksempel en protein utveksling faktor eller et legemiddel, hjelper avsløre mekanismen som samhandlingen er regulert av den andre faktoren, gir viktig kunnskap for den fremme av biologisk og medisinsk forskning. Her beskriver vi en protokoll for å måle bindende kinetics av et protein kompleks som har en høy iboende tilknytning hastighet og kan bli atskilt raskt av en annen protein. Metoden bruker fluorescens resonans energi-overføring til å rapportere dannelsen av protein kompleks i vitro, og du kan overvåke rask foreningen og av komplekset i sanntid på en stoppet-flow fluorimeter. Bruker denne analysen, er association og dissosiasjon rate konstanter av proteinet kvantifisert.
Biologiske aktiviteter utføres til slutt av proteiner, mest som samhandler med andre for riktig biologiske funksjoner. Bruke en beregningsorientert tilnærming, den totale mengden protein-protein interaksjoner i human er anslått til ~ 650 0001og avbrudd i disse samhandlingene ofte fører til sykdommer2. På grunn av deres viktige roller i å kontrollere mobilnettet og organismebiologi prosesser, er mange metoder utviklet for å studere protein-protein interaksjoner, for eksempel gjær-to-hybrid, resultatet av dette fluorescens complementation, split-luciferase complementation og co-immunoprecipitation analysen3. Mens disse metodene er flink til å oppdage og bekrefter protein-protein interaksjoner, de er vanligvis ikke-kvantitative og dermed gir begrenset informasjon om affinitet mellom samspill protein partnerne. Kvantitativ rullegardinlistene kan brukes til å måle forpliktende tilhørighet (f.eks dissosiasjon konstanten Kd), men det måle ikke the kinetics av bindingen eller kan det brukes når Kd er svært lav på grunn av en utilstrekkelig signal-til-støy forholdet4. Overflaten plasmon resonans (SPR) spektroskopi kvantifiserer bindende kinetikk, men det krever en bestemt overflaten og immobilisering av en reactant på overflaten som potensielt kan endre binding-egenskapen reactant5. Videre er det vanskelig for SPR å måle rask association og dissosiasjon priser5, og det er ikke hensiktsmessig å bruke SPR for å karakterisere hendelsen utveksle protein underenheter i et protein kompleks. Her beskriver vi en metode som tillater måling av protein kompleks montering og demontering på et millisekund tidsskalaen. Denne metoden var avgjørende for fastsette rollen til Cullin – ssociated –Nedd8 –dissociated protein 1 (Cand1)i F-boks protein utveksling faktor6,7.
Cand1 regulerer dynamikken i Skp1•Cul1•F-boksen protein (SCF) E3 ligases, som tilhører familien Cullin-RING ubiquitin ligases. SCFs består av cullin Cul1, som binder RING domene protein Rbx1, og en utskiftbare F-boks protein, som rekrutterer underlag og binder Cul1 gjennom adapter protein Skp18. Som en E3 ligase, SCF gir Bøyning av ubiquitin til sin substrat, og aktiveres når underlaget er rekruttert av F-boks protein, og når Cul1 endres av ubiquitin-lignende protein Nedd89. Cand1 binder uforandret Cul1, og ved bindende, det forstyrrer både foreningen Skp1•F-box protein med Cul1 og Bøyning av Nedd8 Cul110,11,12,13. Resultatet Cand1 syntes å være en inhibitor av SCF aktivitet i vitro, men Cand1 mangel på organismer forårsaket som antyder en positiv rolle i Cand1 i å regulere SCF aktiviteter i vivo14,15,16 , 17. dette paradokset ble endelig forklart av en kvantitativ studie som avslørte de dynamiske interaksjonene mellom Cul1, Cand1 og Skp1•F-box protein. Bruker fluorescens resonans energi overføring (bånd) analyser som oppdager dannelsen av SCF og Cul1•Cand1 komplekser, foreningen og dissosiasjon rate konstanter (kpå og kav, henholdsvis) var målt individuelt. Målingene avslørte at både Cand1 og Skp1•F-box protein skjemaet stramt kompleks med Cul1, men den kav av SCF er dramatisk økte med Cand1 og den kav av Cul1•Cand1 økes dramatisk av Skp1•F-box protein6,7. Disse resultatene gir den første og kritiske støtten for definering av rollen for Cand1 som en protein utveksling faktor, som gir dannelsen av nye SCF komplekser gjennom gjenvinning Cul1 fra gamle SCF komplekser.
Her presenterer vi prosedyren for utvikling og bruk av bånd analysen for å studere dynamikken i Cul1•Cand1 komplekse7, og det samme prinsippet kan brukes til å studere dynamikken i ulike biomolecules. BÅND oppstår når en donor er glade med den riktige bølgelengden og en godkjenner med eksitasjon spectrum overlappende donor utslipp spektrum finnes innenfor en avstand på 10-100 Å. Opphisset tilstand overføres til acceptor, og dermed redusere donor intensiteten og øke acceptor intensitet18. Effektiviteten av bånd (E) avhenger både han selvmord radius (R0) og avstanden mellom giver og acceptor fluorophores (r), og er definert av: E = R06/ (R0 6 + r6). Han selvmord radius (R0) avhenger av flere faktorer, inkludert dipol kantete retningen, spectral overlappingen av donor-acceptor paret, og løsningen brukes19. Hvis du vil bruke bånd analysen på en stoppet-flow fluorimeter, som overvåker endring av donor utslipp i sanntid og muliggjør målinger av rask kpå og kav, er det nødvendig å etablere effektive bånd som resulterer i en betydelig reduksjon av donor utslipp. Derfor utforme effektive bånd ved å velge riktig par fluorescerende fargestoffer og områder på målet proteiner knytte fargestoffer er viktig og vil bli diskutert i denne protokollen.
BÅND er et fysisk fenomen av stor interesse for å studere og forstå biologiske systemer19. Her presenterer vi en protokoll for testing og bruk av bånd bindende kinetics to samspill proteiner. Når du utformer bånd, vi vurdert tre viktige faktorer: spectral overlappingen mellom donor utslipp og acceptor eksitasjon, avstanden mellom de to fluorophores og dipol retningen av fluorophores28. Velg fluorophores for bånd, vi kledde eksitasjon og utslipp spektra av fluorophore…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Shu-Ou Shan (California Institute of Technology) for innsiktsfulle diskusjon om utviklingen av bånd analysen. M.G., Y.Z. og X.L. ble finansiert av oppstart penger fra Purdue University til Y.Z. og X.L.This arbeidet var støttes delvis av frø stipend fra Purdue University Center for plante biologi.
Anion exchange chromatography column | GE Healthcare | 17505301 | HiTrap Q FF anion exchange chromatography column |
Benchtop refrigerated centrifuge | Eppendorf | 2231000511 | |
BL21 (DE3) Competent Cells | ThermoFisher Scientific | C600003 | |
Calcium Chloride | Fisher Scientific | C78-500 | |
Cation exchange chromatography column | GE Healthcare | 17505401 | HiTrap SP Sepharose FF |
Desalting Column | GE Healthcare | 17085101 | |
Floor model centrifuge (high speed) | Beckman Coulter | J2-MC | |
Floor model centrifuge (low speed) | Beckman Coulter | J6-MI | |
Fluorescence SpectraViewer | ThermoFisher Scientific | https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cell-analysis/labeling-chemistry/fluorescence-spectraviewer.html | |
FluoroMax fluorimeter | HORIBA | FluoroMax-3 | |
FPLC | GE Healthcare | 29018224 | |
GGGGAMC peptide | New England Peptide | custom synthesis | |
Glutathione beads | GE Healthcare | 17075605 | |
Glycerol | Fisher Scientific | G33-500 | |
HEPES | Fisher Scientific | BP310-100 | |
Isopropyl-β-D-thiogalactoside (IPTG) | Fisher Scientific | 15-529-019 | |
LB Broth | Fisher Scientific | BP1426-500 | |
Ni-NTA agarose | Qiagen | 30210 | |
Ovalbumin | MilliporeSigma | A2512 | |
pGEX-4T-2 vector | GE Healthcare | 28954550 | |
Protease inhibitor cocktail | MilliporeSigma | 4693132001 | |
Reduced glutathione | Fisher Scientific | BP25211 | |
Refrigerated shaker | Eppendorf | M1282-0004 | |
Rosetta Competent Cells | MilliporeSigma | 70953-3 | |
Size exclusion chromatography column | GE Healthcare | 28990944 | Superdex 200 10/300 GL column |
Sodium Chloride (NaCl) | Fisher Scientific | S271-500 | |
Stopped-flow fluorimeter | Hi-Tech Scientific | SF-61 DX2 | |
TCEP·HCl | Fisher Scientific | PI20490 | |
Thrombin | MilliporeSigma | T4648 | |
Tris Base | Fisher Scientific | BP152-500 | |
Ultrafiltration membrane | MilliporeSigma | UFC903008 | Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units, Ultra-15, 30,000 NMWL |