Bruke i Vitro fluorescens resonans energioverføring å studere dynamikken i Protein komplekser på et millisekund tidsskala

Biologiske aktiviteter utføres til slutt av proteiner, mest som samhandler med andre for riktig biologiske funksjoner. Bruke en beregningsorientert tilnærming, den totale mengden protein-protein interaksjoner i human er anslått til ~ 650 000¹og avbrudd i disse samhandlingene ofte fører til sykdommer². På grunn av deres viktige roller i å kontrollere mobilnettet og organismebiologi prosesser, er mange metoder utviklet for å studere protein-protein interaksjoner, for eksempel gjær-to-hybrid, resultatet av dette fluorescens complementation, split-luciferase complementation og co-immunoprecipitation analysen³. Mens disse metodene er flink til å oppdage og bekrefter protein-protein interaksjoner, de er vanligvis ikke-kvantitative og dermed gir begrenset informasjon om affinitet mellom samspill protein partnerne. Kvantitativ rullegardinlistene kan brukes til å måle forpliktende tilhørighet (f.eks dissosiasjon konstanten K_d), men det måle ikke the kinetics av bindingen eller kan det brukes når K_d er svært lav på grunn av en utilstrekkelig signal-til-støy forholdet⁴. Overflaten plasmon resonans (SPR) spektroskopi kvantifiserer bindende kinetikk, men det krever en bestemt overflaten og immobilisering av en reactant på overflaten som potensielt kan endre binding-egenskapen reactant⁵. Videre er det vanskelig for SPR å måle rask association og dissosiasjon priser⁵, og det er ikke hensiktsmessig å bruke SPR for å karakterisere hendelsen utveksle protein underenheter i et protein kompleks. Her beskriver vi en metode som tillater måling av protein kompleks montering og demontering på et millisekund tidsskalaen. Denne metoden var avgjørende for fastsette rollen til Cullin – ssociated –Nedd8 –dissociated protein 1 (Cand1)i F-boks protein utveksling faktor^6,7.

Cand1 regulerer dynamikken i Skp1•Cul1•F-boksen protein (SCF) E3 ligases, som tilhører familien Cullin-RING ubiquitin ligases. SCFs består av cullin Cul1, som binder RING domene protein Rbx1, og en utskiftbare F-boks protein, som rekrutterer underlag og binder Cul1 gjennom adapter protein Skp1⁸. Som en E3 ligase, SCF gir Bøyning av ubiquitin til sin substrat, og aktiveres når underlaget er rekruttert av F-boks protein, og når Cul1 endres av ubiquitin-lignende protein Nedd8⁹. Cand1 binder uforandret Cul1, og ved bindende, det forstyrrer både foreningen Skp1•F-box protein med Cul1 og Bøyning av Nedd8 Cul1^10,11,12,13. Resultatet Cand1 syntes å være en inhibitor av SCF aktivitet i vitro, men Cand1 mangel på organismer forårsaket som antyder en positiv rolle i Cand1 i å regulere SCF aktiviteter i vivo^{14,15,16 , 17}. dette paradokset ble endelig forklart av en kvantitativ studie som avslørte de dynamiske interaksjonene mellom Cul1, Cand1 og Skp1•F-box protein. Bruker fluorescens resonans energi overføring (bånd) analyser som oppdager dannelsen av SCF og Cul1•Cand1 komplekser, foreningen og dissosiasjon rate konstanter (k_på og k_av, henholdsvis) var målt individuelt. Målingene avslørte at både Cand1 og Skp1•F-box protein skjemaet stramt kompleks med Cul1, men den k_av av SCF er dramatisk økte med Cand1 og den k_av av Cul1•Cand1 økes dramatisk av Skp1•F-box protein^6,7. Disse resultatene gir den første og kritiske støtten for definering av rollen for Cand1 som en protein utveksling faktor, som gir dannelsen av nye SCF komplekser gjennom gjenvinning Cul1 fra gamle SCF komplekser.

Her presenterer vi prosedyren for utvikling og bruk av bånd analysen for å studere dynamikken i Cul1•Cand1 komplekse⁷, og det samme prinsippet kan brukes til å studere dynamikken i ulike biomolecules. BÅND oppstår når en donor er glade med den riktige bølgelengden og en godkjenner med eksitasjon spectrum overlappende donor utslipp spektrum finnes innenfor en avstand på 10-100 Å. Opphisset tilstand overføres til acceptor, og dermed redusere donor intensiteten og øke acceptor intensitet¹⁸. Effektiviteten av bånd (E) avhenger både han selvmord radius (R₀) og avstanden mellom giver og acceptor fluorophores (r), og er definert av: E = R₀⁶/ (R₀ ⁶ + r⁶). Han selvmord radius (R₀) avhenger av flere faktorer, inkludert dipol kantete retningen, spectral overlappingen av donor-acceptor paret, og løsningen brukes¹⁹. Hvis du vil bruke bånd analysen på en stoppet-flow fluorimeter, som overvåker endring av donor utslipp i sanntid og muliggjør målinger av rask k_på og k_av, er det nødvendig å etablere effektive bånd som resulterer i en betydelig reduksjon av donor utslipp. Derfor utforme effektive bånd ved å velge riktig par fluorescerende fargestoffer og områder på målet proteiner knytte fargestoffer er viktig og vil bli diskutert i denne protokollen.