체 외 형광 공명 에너지 전달에 밀리초 시간 규모에서 단백질 복합물의 역학을 공부 하는 사용 하 여

생물 학적 활동은 궁극적으로 대부분의 사람들과 상호 작용 적절 한 생물 학적 기능에 대 한 단백질에 의해 수행. 계산 방식을 사용 하 여, 인간의 단백질 단백질 상호 작용의 총 금액 650000 ~¹, 추정 되 고 종종 이러한 상호 작용의 혼란 리드 질병². 세포질 organismal 과정 통제에 그들의 필수적인 역할 때문 수많은 방법은 효 모 2 잡종, 분자 형광 보완성, 분할 luciferase 단백질 단백질 상호 작용 연구 개발 되었습니다. 보완성, 그리고 공동-immunoprecipitation 분석 결과³. 이러한 방법을 발견 하 고 확인 하는 단백질 단백질 상호 작용에 좋은 동안, 그들은 일반적으로 비 양적 하 고 따라서 상호 작용 단백질 파트너 간의 선호도 대 한 제한 된 정보를 제공. 양적 풀-다운 바인딩 선호도 (예: 분리 상수 K_d)를 측정 하기 위해 사용할 수 있습니다 하지만 그것은 바인딩의 활동을 측정 하지 않습니다도 적용할 수 있는 그것은 K_d 는 부적당 한 것으로 인해 매우 낮은 때 신호 대 잡음 비율⁴. 표면 플라스몬 공명 (SPR) 분광학 단정 바인딩 활동 있지만 특정 표면 및 잠재적으로 반응⁵의 바인딩 속성을 바꿀 수 있는 표면에 1 개의 반응의 동원 정지 합니다. 또한, 빠른 연결 및 분리 속도⁵, 측정 하는 SPR 어렵습니다 그리고 그것은 SPR 교환 단백질 복잡 한 소 단위 단백질의 이벤트 특성을 사용 하 여 적절 한. 여기, 우리는 단백질 복잡 한 조립과 해체 밀리초 시간 규모에서의 속도 측정을 허용 하는 방법을 설명 합니다. 이 방법은 F 상자 단백질 교환 요소^6,7 C율 린-ssociated-Nedd8-dissociated 단백질 1 (Cand1)의 역할을 결정 하기 위한 필수적 이었다.

Cand1은 Cullin 링 유비퀴틴 ligases의 큰 가족에 속하는 Skp1•Cul1•F 상자 단백질 (SCF) E3 ligases의 역학을 조절. SCFs 바인딩 링 도메인 단백질 Rbx1, Cul1 및 기판 신병 및 Cul1 접합 기 단백질 Skp1⁸통해 바인딩하는 상호 교환 F 상자 단백질 cullin로 구성 됩니다. E3 리가 SCF catalyzes 유비퀴틴의 기판에의 활용 그리고 기판 F 상자 단백질에 의해 모집 및 Cul1 유비퀴틴-같은 단백질 Nedd8⁹에 의해 수정 될 때 활성화 됩니다. Cand1 수정 되지 않은 Cul1 한다 Cul1와 Skp1•F-상자 단백질의 협회와 Cul1^10,11,,1213Nedd8 활용을 모두 바인딩 시 방해. 결과적으로, Cand1 SCF 활동 생체 외에서의 억제제 등장 하지만 생물에서 Cand1 결핍 발생 vivo^14,,1516 에 SCF 활동 조절에 Cand1의 긍정적인 역할을 제안 하는 결점 ^{, 17}.이 역설은 마지막으로 Cul1, Cand1, 및 Skp1•F 상자 단백질 간의 동적 상호 작용을 밝혀 양적 연구에 의해 설명 했다. 형광 공명 에너지 전달 (무서 워) 분석 실험 SCF 및 Cul1•Cand1 단지의 형성을 검출 하는 사용 하 여, 협회 및 분리 속도 상수 (k_에 / k_에서각각) 했다 개별적으로 측정. Cand1와 Skp1•F-상자 단백질 형태로 매우 엄격한 복잡 한 Cul1, 그러나에서 _떨어져 k SCF의 Cand1에 의해 극적으로 증가 하 고 있는 k_에서 Cul1•Cand1는 극적으로 증가 했다 측정 공개 Skp1•F-상자 단백질^6,7여. 이 결과 Cul1 이전 SCF 단지에서 재활용을 통해 새로운 SCF 단지의 형성 catalyzes 단백질 교환 요인으로 Cand1의 역할을 정의 하기 위한 초기 및 중요 한 지원을 제공 합니다.

여기, 우리가 개발 하 고 무서 워 분석 결과 사용 하 여 Cul1•Cand1 복잡 한⁷의 역학 연구의 절차를 제시 하 고 다양 한 생체 역학 연구에 동일한 원리를 적용할 수 있습니다. 무서 워 기증자는 적절 한 파장에 흥분 하 고 기증자 방출 스펙트럼 중복 여기 스펙트럼과 수락자 10-100의 거리 내에 존재 하는 경우에 발생 합니다 Å. 흥분된 상태 함으로써 기증자 강도 감소 하 고 증가 하는 수락자 강도¹⁸수락자로 전송 됩니다. 무서 워 (E)의 효율성 포스터 반경 (R₀) 및 (r), 기증자 및 수락자 fluorophores 사이의 거리에 따라 달라 집니다 그리고에 의해 정의 됩니다: E = R₀⁶/ (R₀ ⁶ + r⁶). 포스터 반경 (R₀) 쌍 극 자 각도 방향 등 몇 가지 요인에 따라 달라 집니다, 그리고 기증자 수락자 쌍 및 솔루션의 스펙트럼 중복 사용¹⁹. 실시간으로 기증자 방출의 변화를 모니터링 하 고 빠른 _에 k에 와 k_에서측정, 중지 흐름 fluorimeter에 무서 워 분석 결과 적용 하려면 그것은 효율적인 무서 워를 설정 하는 데 필요한 하 기증자 방출의 뜻깊은 감소에 있는 결과. 따라서, 염료를 연결할 대상 단백질에 형광 염료와의 적절 한 쌍을 선택 하 여 효율적인 무서 워 설계 중요 하 고이 프로토콜에서 설명 합니다.