À l’aide au transfert d’énergie Fluorescence in Vitro pour étudier la dynamique des protéines Complexes à une échelle de temps de milliseconde

Activités biologiques sont effectuées en fin de compte par des protéines, plus de qui interagissent avec les autres pour des fonctions biologiques appropriées. En utilisant une approche computationnelle, le montant total des interactions protéine-protéine chez l’homme est estimé à ~ 650 000¹et perturbation de ces interactions souvent conduit à des maladies². En raison de leur rôle essentiel dans le contrôle des processus cellulaires et organismiques, plusieurs méthodes ont été développées pour l’étude des interactions protéine-protéine, comme deux-hybride de levure, complémentation de fluorescence bimoléculaire, split-luciférase complémentation et co-immunoprécipitation test³. Si ces méthodes sont bons à découvrir et confirmant les interactions protéine-protéine, ils sont généralement non quantitative et ainsi fournissent des informations limitées sur les affinités entre les partenaires de protéines qui interagissent. Pull-down quantitative peut être utilisé pour mesurer l’affinité de liaison (par exemple, la constante de dissociation K_d), mais elle ne mesure pas la cinétique de la liaison, ni peut il être appliqué lorsque le K_d est très faible en raison d’une insuffisante rapport signal-sur-bruit⁴. Plasmonique de surface (SPR) spectroscopie quantifie la cinétique de la liaison, mais il nécessite une surface spécifique et l’immobilisation d’un réactif à la surface, ce qui peut potentiellement modifier la propriété de liaison du réactif⁵. En outre, il est difficile pour la SPR mesurer rapidement association et dissociation taux⁵, et il n’est pas approprié d’utiliser la SPR pour caractériser l’événement de l’échange de sous-unités protéiques dans un complexe de protéines. Nous décrivons ici une méthode qui permet de mesurer le taux de protéine complexe montage et démontage à une échelle de temps de milliseconde. Cette méthode a été essentielle pour déterminer le rôle d’ullin –unssociated –Nedd8 –dissociated protéine C 1 (Cand1) que le F-box protéine échange facteur^6,7.

Cand1 régule la dynamique des ligases de E3 des protéines (SCF) Skp1•Cul1•F-box, qui appartiennent à la grande famille d’ubiquitine ligases de Cullin-RING. Les CCS comprennent le cullin Cul1, qui se lie à la protéine de domaine RING Rbx1, et une protéine F-box interchangeable, qui recrute des substrats et lie Cul1 par l’intermédiaire de la protéine adaptatrice Skp1⁸. Comme une ligase E3, SCF catalyse la conjugaison de l’ubiquitine sur son support, et il est activé lorsque le substrat est recruté par la protéine F-box et lorsque Cul1 est modifié par l’ubiquitine-comme la protéine Nedd8⁹. Cand1 lie Cul1 non modifié, et lors de la liaison, il perturbe tant l’association de la protéine Skp1•F-box avec Cul1 que la conjugaison de Nedd8 Cul1^10,11,12,13. Ainsi, Cand1 semble être un inhibiteur de l’activité in vitro SCF, mais une carence en Cand1 dans les organismes causé défauts qui suggère un rôle positif de Cand1 dans la régulation des activités SCF dans vivo^{14,15,16 , 17}. ce paradoxe a enfin expliqué par une étude quantitative qui a révélé les interactions dynamiques entre les protéines Cul1, Cand1 et Skp1•F-box. Utilisant la fluorescence resonance energy transfert (FRET) de détecter la formation de l’EFC et Cul1•Cand1 complexes, l’association et dissociation constantes de vitesse (k_sur et k_off, respectivement) ont été mesurée individuellement. Les mesures ont révélé que fois Cand1 et Skp1•F-boîte forme extrêmement serré complexe protéique avec Cul1, mais le k_hors du SCF est considérablement augmenté par Cand1 et augmente considérablement la k_hors de Cul1•Cand1 par Skp1•F-case protéine^6,7. Ces résultats fournissent la prise en charge initiale et critique pour définir le rôle de Cand1 comme un facteur d’échange de protéine, qui catalyse la formation de nouveaux complexes SCF grâce au recyclage Cul1 depuis les vieux complexes SCF.

Ici, nous présentons la procédure de développement et l’utilisation de l’essai de frette pour étudier la dynamique du complexe Cul1•Cand1⁷, et le même principe peut être appliqué afin d’étudier la dynamique des diverses biomolécules. FRETTE se produit lorsqu’un donneur est excité par la longueur d’onde appropriée et un accepteur avec spectre d’excitation qui se chevauchent le spectre d’émission de donneur est présent dans un rayon de 10-100 Å. L’état excité est transféré à l’accepteur, ce qui diminue l’intensité des donateurs et augmentant l’accepteur intensité¹⁸. L’efficacité du FRET (E) dépend de la distance entre les fluorophores donneur et accepteur (r) et le rayon de Förster (R,₀) et est définie par : E = R₀⁶/ (R₀ ⁶ + r⁶). Le rayon de Förster (R₀) dépend de quelques facteurs, y compris l’orientation angulaire du dipôle, le chevauchement spectral de la paire de donneur-accepteur et la solution utilisé¹⁹. Pour appliquer le test FRET sur un fluorimètre flux stoppé, qui surveille le changement de l’émission du donneur en temps réel et permet des mesures rapides k_sur et k_off, il est nécessaire d’établir la frette efficace qui entraîne une réduction significative des émissions de donateurs. Par conséquent, conception efficace frette en choisissant la paire appropriée de colorants fluorescents et sites sur les protéines cibles pour fixer les teintures est importante et est discutée dans le présent protocole.