Bruger i Vitro fluorescens resonans energioverførsel at studere dynamikken i proteinkomplekser på en millisekund tidsskala

Biologiske aktiviteter udføres i sidste ende af proteiner, mest som interagerer med andre for ordentlig biologiske funktioner. Brug af et beregningsprogram tilgang, den samlede mængde protein-protein interaktioner i menneskelige skønnes for at være ~ 650.000¹, og afbrydelse af disse interaktioner ofte fører til sygdomme². På grund af deres væsentlige roller i at kontrollere cellulært og kropsligt processer, er talrige metoder blevet udviklet for at studere protein-protein interaktioner, såsom gær-to-hybrid, bimolecular fluorescens komplementering, split-luciferase komplementering, og co-immunoprecipitation assay³. Mens disse metoder er gode til at opdage og bekræfter protein-protein interaktioner, de er normalt ikke-kvantitative og dermed giver begrænsede oplysninger om affinitet mellem de interagerende protein partnere. Kvantitative pull-downs kan bruges til at måle bindingsaffinitet (f.eks. dissociationskonstant K_d), men det måle ikke kinetik af bindingen, og heller ikke kan det anvendes når K_d er meget lav på grund af en utilstrækkelig signal-støj-forholdet⁴. Overflade plasmon resonans (SPR) spektroskopi kvantificerer bindende kinetik, men det kræver en specifik overflade og immobilisering af en reaktant på overfladen, som potentielt kan ændre egenskaben binding af reaktanter⁵. Desuden er det vanskeligt for SPR at måle hurtig association og dissociation satser⁵, og det er ikke hensigtsmæssigt at bruge SPR for at karakterisere begivenhed for at udveksle protein underenheder i et proteinkompleks. Her, beskriver vi en metode, der giver mulighed for måling af satserne for protein kompleks samling og demontering på en millisekund tidsskala. Denne metode var afgørende for bestemmelse af Cullin –enssociated –Nedd8 –dissociated protein 1 (Cand1) betydning som F-boks protein udveksling faktor^6,7.

Cand1 regulerer dynamikken i Skp1•Cul1•F-box protein (SCF) E3 ligases, som hører til den store familie af Cullin søerne-RING ubiquitin ligases. SCFs består af cullin Cul1, som binder RING domæne protein Rbx1, og et udskifteligt F-boks protein, som rekrutterer substrater og binder Cul1 gennem adapter protein Skp1⁸. Som en E3 ligase, SCF katalyserer konjugation af ubiquitin til sit bæremateriale, og det er aktiveret når substratet er rekrutteret af F-boks protein, og når Cul1 er ændret af ubiquitin-lignende protein Nedd8⁹. Cand1 binder umodificeret Cul1, og efter bindende, det forstyrrer både sammenslutningen af Skp1•F-box protein med Cul1 og konjugering af Nedd8 til Cul1^10,11,12,13. Som følge heraf Cand1 syntes at være en hæmmer af SCF aktivitet in vitro, men Cand1 mangel i organismer forårsaget defekter, der antyder en positiv rolle i Cand1 i reguleringen af SCF aktiviteter i vivo^{14,15,16 , 17}. dette paradoks blev endelig forklares ved en kvantitativ undersøgelse, der afslørede de dynamiske interaktioner blandt Cul1, Cand1 og Skp1•F-box protein. Ved hjælp af fluorescens resonans energi overførsel (FRET) assays, der registrerer dannelsen af de videnskabelige komité for levnedsmidler og Cul1•Cand1 komplekser, association og dissociation Vurder konstanter (k_på og k_ud, henholdsvis) var målt individuelt. Målingerne viste, at både Cand1 og Skp1•F-box protein form yderst stramme kompleks med Cul1, men de k_ud af SCF øges dramatisk af Cand1 og den k_ud af Cul1•Cand1 øges dramatisk af Skp1•F-box protein^6,7. Disse resultater giver den første og afgørende støtte for definitionen af Cand1 som et protein udveksling faktor, som katalyserer dannelsen af nye SCF komplekser gennem genbrug Cul1 fra de gamle SCF komplekser.

Her præsenterer vi proceduren for udvikling og anvendelse af FRET analysen for at studere dynamikken i Cul1•Cand1 komplekse⁷, og det samme princip kan anvendes for at studere dynamikken i forskellige biomolekyler. FRET opstår, når en donor er spændt med den passende bølgelængde, og en acceptor med excitation spektrum overlappende donor emission spektrum er til stede inden for en afstand på 10-100 Å. Den eksiterede tilstand er overført til acceptor, dermed faldende donor intensitet og øge acceptor intensitet¹⁸. FRET (E) effektivitet afhænger af både Förster radius (R₀) og afstanden mellem donor og acceptor fluorophores (r), og er defineret af: E = R₀⁶/ (R₀ ⁶ + r⁶). Förster radius (R₀) afhænger af et par faktorer, herunder dipol kantede orientering, den spektrale overlapning af donor-acceptor par, og løsningen anvendes¹⁹. Hvis du vil anvende FRET analysen på en stoppet-flow fluorimeter, som overvåger ændringen af donor emission i realtid og gør det muligt for målinger af hurtig k_på og k_ud, det er nødvendigt at fastlægge effektive FRET der resulterer i en betydelig reduktion af donor emission. Derfor udforme effektive FRET ved at vælge den passende par fluorescerende farvestoffer og websteder på target proteiner til at vedhæfte farvestofferne er vigtig og vil blive drøftet i denne protokol.