Protein-protein interaktioner er kritisk for biologiske systemer, og undersøgelser af bindende kinetik give indsigt i den dynamik og funktion af proteinkomplekser. Vi beskriver en metode, der kvantificerer kinetiske parametre for et proteinkompleks ved hjælp af fluorescens resonans energioverførsel og stoppede strømmen teknik.
Proteiner er de primære aktører i biologiske systemer, og de interagerer normalt med andre makro- eller små molekyler til at udføre deres biologiske funktioner. Sådanne interaktioner kan være meget dynamisk, hvilket betyder de interagerende underenheder er konstant forbundet og adskilt til bestemte priser. Mens måling bindende affinitet ved hjælp af teknikker, såsom kvantitative pull-down afslører styrken af interaktion, studerer bindende kinetik giver indsigt i, hvordan hurtigt vekselvirkningen opstår og hvor længe hver kompleks kan eksistere. Derudover måling kinetik af en interaktion ved tilstedeværelse af en yderligere faktor, som et protein udveksling faktor eller et stof, hjælper afslører den mekanisme, hvormed samspillet er reguleret af den anden faktor, give vigtig viden til de fremme af biologisk og medicinsk forskning. Her, beskriver vi en protokol til måling af den bindende kinetik af et protein kompleks, der har en høj iboende association og kan adskilles hurtigt af et andet protein. Metoden bruger fluorescens resonans energioverførsel rapportere dannelsen af protein kompleks in vitro, og det giver mulighed for overvågning af hurtig association og dissociation af kompleks i realtid på en stoppet-flow fluorimeter. Ved hjælp af denne analyse, er association og dissociation sats konstanter protein kompleks kvantificeret.
Biologiske aktiviteter udføres i sidste ende af proteiner, mest som interagerer med andre for ordentlig biologiske funktioner. Brug af et beregningsprogram tilgang, den samlede mængde protein-protein interaktioner i menneskelige skønnes for at være ~ 650.0001, og afbrydelse af disse interaktioner ofte fører til sygdomme2. På grund af deres væsentlige roller i at kontrollere cellulært og kropsligt processer, er talrige metoder blevet udviklet for at studere protein-protein interaktioner, såsom gær-to-hybrid, bimolecular fluorescens komplementering, split-luciferase komplementering, og co-immunoprecipitation assay3. Mens disse metoder er gode til at opdage og bekræfter protein-protein interaktioner, de er normalt ikke-kvantitative og dermed giver begrænsede oplysninger om affinitet mellem de interagerende protein partnere. Kvantitative pull-downs kan bruges til at måle bindingsaffinitet (f.eks. dissociationskonstant Kd), men det måle ikke kinetik af bindingen, og heller ikke kan det anvendes når Kd er meget lav på grund af en utilstrækkelig signal-støj-forholdet4. Overflade plasmon resonans (SPR) spektroskopi kvantificerer bindende kinetik, men det kræver en specifik overflade og immobilisering af en reaktant på overfladen, som potentielt kan ændre egenskaben binding af reaktanter5. Desuden er det vanskeligt for SPR at måle hurtig association og dissociation satser5, og det er ikke hensigtsmæssigt at bruge SPR for at karakterisere begivenhed for at udveksle protein underenheder i et proteinkompleks. Her, beskriver vi en metode, der giver mulighed for måling af satserne for protein kompleks samling og demontering på en millisekund tidsskala. Denne metode var afgørende for bestemmelse af Cullin –enssociated –Nedd8 –dissociated protein 1 (Cand1) betydning som F-boks protein udveksling faktor6,7.
Cand1 regulerer dynamikken i Skp1•Cul1•F-box protein (SCF) E3 ligases, som hører til den store familie af Cullin søerne-RING ubiquitin ligases. SCFs består af cullin Cul1, som binder RING domæne protein Rbx1, og et udskifteligt F-boks protein, som rekrutterer substrater og binder Cul1 gennem adapter protein Skp18. Som en E3 ligase, SCF katalyserer konjugation af ubiquitin til sit bæremateriale, og det er aktiveret når substratet er rekrutteret af F-boks protein, og når Cul1 er ændret af ubiquitin-lignende protein Nedd89. Cand1 binder umodificeret Cul1, og efter bindende, det forstyrrer både sammenslutningen af Skp1•F-box protein med Cul1 og konjugering af Nedd8 til Cul110,11,12,13. Som følge heraf Cand1 syntes at være en hæmmer af SCF aktivitet in vitro, men Cand1 mangel i organismer forårsaget defekter, der antyder en positiv rolle i Cand1 i reguleringen af SCF aktiviteter i vivo14,15,16 , 17. dette paradoks blev endelig forklares ved en kvantitativ undersøgelse, der afslørede de dynamiske interaktioner blandt Cul1, Cand1 og Skp1•F-box protein. Ved hjælp af fluorescens resonans energi overførsel (FRET) assays, der registrerer dannelsen af de videnskabelige komité for levnedsmidler og Cul1•Cand1 komplekser, association og dissociation Vurder konstanter (kpå og kud, henholdsvis) var målt individuelt. Målingerne viste, at både Cand1 og Skp1•F-box protein form yderst stramme kompleks med Cul1, men de kud af SCF øges dramatisk af Cand1 og den kud af Cul1•Cand1 øges dramatisk af Skp1•F-box protein6,7. Disse resultater giver den første og afgørende støtte for definitionen af Cand1 som et protein udveksling faktor, som katalyserer dannelsen af nye SCF komplekser gennem genbrug Cul1 fra de gamle SCF komplekser.
Her præsenterer vi proceduren for udvikling og anvendelse af FRET analysen for at studere dynamikken i Cul1•Cand1 komplekse7, og det samme princip kan anvendes for at studere dynamikken i forskellige biomolekyler. FRET opstår, når en donor er spændt med den passende bølgelængde, og en acceptor med excitation spektrum overlappende donor emission spektrum er til stede inden for en afstand på 10-100 Å. Den eksiterede tilstand er overført til acceptor, dermed faldende donor intensitet og øge acceptor intensitet18. FRET (E) effektivitet afhænger af både Förster radius (R0) og afstanden mellem donor og acceptor fluorophores (r), og er defineret af: E = R06/ (R0 6 + r6). Förster radius (R0) afhænger af et par faktorer, herunder dipol kantede orientering, den spektrale overlapning af donor-acceptor par, og løsningen anvendes19. Hvis du vil anvende FRET analysen på en stoppet-flow fluorimeter, som overvåger ændringen af donor emission i realtid og gør det muligt for målinger af hurtig kpå og kud, det er nødvendigt at fastlægge effektive FRET der resulterer i en betydelig reduktion af donor emission. Derfor udforme effektive FRET ved at vælge den passende par fluorescerende farvestoffer og websteder på target proteiner til at vedhæfte farvestofferne er vigtig og vil blive drøftet i denne protokol.
FRET er et fysisk fænomen, som er af stor interesse for at studere og forstå biologiske systemer19. Vi præsenterer her, en protokol for afprøvning og brug af FRET for at studere bindende kinetik af to interagerende proteiner. Når du udformer FRET, vi anså tre hovedfaktorer: den spektrale overlapning mellem donor emission og acceptor excitation, afstanden mellem de to fluorophores og dipol orientering af fluorophores28. For at vælge fluorophores for FRET, vi overlejre…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Shu-Ou Shan (California Institute of Technology) for indsigtsfulde diskussion om udviklingen af FRET assay. M.G., Y.Z. og X.L. blev finansieret af startup midler fra Purdue University til Y.Z. og X.L.This arbejde blev delvist understøttet af et frø tilskud fra Purdue University Center for Plantebiologi.
Anion exchange chromatography column | GE Healthcare | 17505301 | HiTrap Q FF anion exchange chromatography column |
Benchtop refrigerated centrifuge | Eppendorf | 2231000511 | |
BL21 (DE3) Competent Cells | ThermoFisher Scientific | C600003 | |
Calcium Chloride | Fisher Scientific | C78-500 | |
Cation exchange chromatography column | GE Healthcare | 17505401 | HiTrap SP Sepharose FF |
Desalting Column | GE Healthcare | 17085101 | |
Floor model centrifuge (high speed) | Beckman Coulter | J2-MC | |
Floor model centrifuge (low speed) | Beckman Coulter | J6-MI | |
Fluorescence SpectraViewer | ThermoFisher Scientific | https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cell-analysis/labeling-chemistry/fluorescence-spectraviewer.html | |
FluoroMax fluorimeter | HORIBA | FluoroMax-3 | |
FPLC | GE Healthcare | 29018224 | |
GGGGAMC peptide | New England Peptide | custom synthesis | |
Glutathione beads | GE Healthcare | 17075605 | |
Glycerol | Fisher Scientific | G33-500 | |
HEPES | Fisher Scientific | BP310-100 | |
Isopropyl-β-D-thiogalactoside (IPTG) | Fisher Scientific | 15-529-019 | |
LB Broth | Fisher Scientific | BP1426-500 | |
Ni-NTA agarose | Qiagen | 30210 | |
Ovalbumin | MilliporeSigma | A2512 | |
pGEX-4T-2 vector | GE Healthcare | 28954550 | |
Protease inhibitor cocktail | MilliporeSigma | 4693132001 | |
Reduced glutathione | Fisher Scientific | BP25211 | |
Refrigerated shaker | Eppendorf | M1282-0004 | |
Rosetta Competent Cells | MilliporeSigma | 70953-3 | |
Size exclusion chromatography column | GE Healthcare | 28990944 | Superdex 200 10/300 GL column |
Sodium Chloride (NaCl) | Fisher Scientific | S271-500 | |
Stopped-flow fluorimeter | Hi-Tech Scientific | SF-61 DX2 | |
TCEP·HCl | Fisher Scientific | PI20490 | |
Thrombin | MilliporeSigma | T4648 | |
Tris Base | Fisher Scientific | BP152-500 | |
Ultrafiltration membrane | MilliporeSigma | UFC903008 | Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units, Ultra-15, 30,000 NMWL |