Kimliği roman CK2 kinaz yüzeylerde çok yönlü bir biyokimyasal yaklaşım kullanarak
Summary
Etiket, zenginleştirmek ve protein kinaz CK2 hücre lysate veya doku homogenate gibi karmaşık bir biyolojik örnekten yüzeylerde belirlemek için bu iletişim kuralını hedefidir. Bu yöntem CK2 Biyoloji benzersiz özelliklerini bu amaç için kaldıraç görevi yapar.
Abstract
Kinaz-substrat ilişkileri Bu enzimler ve aşağı akım hedeflerine fizyolojik ve patolojik Birleşik Devletleri fonksiyonları tam bir anlayış kazanmak için önemli bir çalışmadır. CK2 bir evrimsel korunmuş serin/treonin kinaz ile gittikçe artan sayıda yüzeylerde birden çok hücresel süreçlerinde yer alan yüzlerce var. Pleiotropic özellikleri nedeniyle belirlenmesi ve CK2 yüzeylerde kapsamlı bir dizi karakterize özellikle zor olmuştur ve bu önemli enzim çalışmada bir engel olarak kalır. Bu sorun adrese hedeflenen zenginleştirme ve sözde CK2 yüzeylerde tanımlaması sağlayan çok yönlü bir deneysel strateji geliştirmiştir. Bu iletişim kuralı, bir hücre veya doku onun yüzeylerde özel thiophosphorylation için lysate izin benzersiz Çift ortak substrat özgüllüğü CK2 yararlanır. Daha sonra bu substrat proteinler vardır, immunoprecipitated, alkylated ve sıvı Kromatografi/tandem kütle spektrometresi (LC-MS/MS) tarafından tespit edilmiştir. Biz daha önce bu yaklaşım başarılı bir şekilde CK2 yüzeylerde Drosophila yumurtalıklar üzerinden tanımlamak için kullanılan ve burada araştırmak için bu yöntemin uyum gösteren insan glioblastoma hücreleri, bu iletişim kuralını uygulamaya uzatmak Bu kinaz çeşitli model organizmalar ve deneysel sistemleri biyolojik rolleri.
Introduction
Protein kinaz sinyal iletim cascades anahtar bileşenleridir. Fosforilasyon tarafından Bu enzim substrat proteinlerin biyolojik yanıt-e doğru kontrol hücre bölünmesi, metabolizma ve farklılaşma, diğerleri arasında kritik olayları düzenleyen ortaya çıkarır. Bu Maya insanlar için korunmuş ve bu transkripsiyon Yönetmeliği hücre döngüsü ilerleme apoptosis1 kadar uzanan birçok hücresel süreçler önemli roller oynar ubiquitously ifade, acidophilic serin/treonin kinaz CK2 olduğunu ,2,3. İki katalitik α oluşan bir heterotetramer enzimdir (veya α’) alt birimleri ve iki düzenleyici β alt birimleri4. Son derece pleiotropic olmasının yanı sıra, CK2, analizleri, karmaşık hale iki diğer sıradışı özellikleri Yani bünye etkinlik5 ve ikili ortak substrat özgüllüğü6sergiler. Bu ikinci özellik GTP hem de ATP substrat protein fosforilasyon için kullanma yeteneği ile CK2 endows.
Embriyonik ölümcül geliştirme ve organogenesis7,8sırasında çok önemli roller oynayan gösteren CK2 katalitik veya düzenleyici altbirimden farelerde genetik silinmesiyle sonuçlanır. CK2 de kanser çeşitli overexpressed ve böylece gelecek vaat eden bir terapötik hedef9,10,11temsil eder. Gerçekten de, belirli inhibitörleri bu hedef CK2 kinaz aktivitesi vardır şu anda bu amaç12,13,14soruşturma altında. Süre CK2 inhibisyonu pleiotropic doğası, alternatif verilen uygun bir seçenek ve belki de daha akılcı yaklaşım bazı kanserler ilerlemesini altında yatan kritik CK2 yüzeylerde hedef olacaktır. Bu nedenle, kapsamlı kimlik ve CK2 yüzey proteinleri karakterizasyonu bu kinaz belirli bir doku veya tümör tür içinde belirli function(s) elucidating için önemli yararı olacaktır.
Burada, bir hücre veya doku lysate gibi karmaşık bir biyolojik örnek üzerinden CK2 yüzeylerde tanımlamak için çok yönlü bir biyokimyasal yöntem açıklanmaktadır. Bu iletişim kuralı CK2 ikili ortak substrat özgüllüğü GTP analog GTPγS (diğer endojen kinaz kullanamazsınız guanozin 5′-[γ-thio]triphosphate). kullanımı tarafından yararlanır Bu etkili bir şekilde “onun yüzeylerde içinde bu örnek sonraki yalıtım ve kimlik için etiketlemek” kinaz sağlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada, karmaşık bir biyolojik örnek üzerinden protein kinaz CK2 yüzeylerde tanımlamak için nispeten basit bir biyokimyasal yöntem açıklanmaktadır. Bu protokol kritik adımları CK2 enzimatik sıradışı özelliklerini temel alan ve CK2 bağlı thiophosphorylation GTPγS ve onların sonraki immunoprecipitation ve kimlik kullanarak belirli yüzey proteinleri içerir. Şimdi bu strateji insan glioblastoma hücreleri ve Drosophila yumurtalık18uyguladığınız gibi bu s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser kısmen Pennsylvania Sağlık Bakanlığı T.I.S. bir İngiliz Milletler Topluluğu evrensel araştırma geliştirme hibe tarafından desteklenmiştir
Materials
| 12 mg/mL PNBM | Abcam | ab138910 | 40.5 µL |
| 2.5 mM GTPγS | Sigma-Aldrich | G8634-1MG | 5.4 µL |
| Anti-CK2α (E-7) mouse monoclonal antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-373894 | 1:1000 for Western blotting |
| Anti-GAPDH (6C5) mouse monoclonal antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-32233 | 1:1000 for Western blotting |
| Anti-nucleolin rabbit polyclonal antibody | Abcam | ab22758 | 1:1000 for Western blotting |
| Anti-thiophosphate ester [51-8] rabbit monoclonal antibody | Abcam | ab92570 | Varies (final concentration 2.8 µg for each sample) |
| Centrifuge pre-set to 4ºC | ThermoScientific | Sorvall Legend Micro 21R Cat# 75-772-436 | |
| cOmplete Mini EDTA-Free Protease Inhibitor | Roche | 11836170001 | |
| Lysis Buffer | See recipe below | See recipe below | 30 mL |
| Normal rabbit IgG antibody (isotype control) | Cell Signaling Technology | 2729S | Varies (final concentration 2.8 µg for each sample) |
| PD MiniTrap Column | GE Healthcare | 28-9180-10 | 3 columns |
| Protein A/G Plus Agarose Beads | Santa Cruz Biotechnology | sc-2003 | 600 µL |
| Recombinant human CK2 holoenzyme | New England Biolabs | P6010S | 2.7 µL |
| Rotator | Labnet: Mini Labroller | Mini Labroller SKU# H5500 | |
| T98G human glioblastoma cells | ATCC | CRL-1690 | |
| Water bath pre-set to 30ºC | Shel Lab | H20 Bath Series Model# SWB15 |
References
- Litchfield, D. W. Protein kinase CK2: structure, regulation and role in cellular decisions of life and death. Biochemical Journal. 369 (Pt 1), 1-15 (2003).
- Ahmed, K., Gerber, D. A., Cochet, C. Joining the cell survival squad: an emerging role for protein kinase CK2). Trends in Cell Biology. 12 (5), 226-230 (2002).
- Meggio, F., Pinna, L. A. One-thousand-and-one substrates of protein kinase CK2. The FASEB Journal. 17 (3), 349-368 (2003).
- Niefind, K., Guerra, B., Ermakowa, I., Issinger, O. G. Crystal structure of human protein kinase CK2: insights into basic properties of the CK2 holoenzyme. The EMBO Journal. 20 (19), 5320-5331 (2001).
- Sarno, S., Ghisellini, P., Pinna, L. A. Unique activation mechanism of protein kinase CK2. The N-terminal segment is essential for constitutive activity of the catalytic subunit but not of the holoenzyme. Journal of Biological Chemistry. 277 (25), 22509-22514 (2002).
- Niefind, K., Putter, M., Guerra, B., Issinger, O. G., Schomburg, D. GTP plus water mimic ATP in the active site of protein kinase CK2. Nature Structural & Molecular Biology. 6 (12), 1100-1103 (1999).
- Lou, D. Y., et al. The alpha catalytic subunit of protein kinase CK2 is required for mouse embryonic development. Molecular and Cellular Biology. 28 (1), 131-139 (2008).
- Buchou, T., et al. Disruption of the regulatory beta subunit of protein kinase CK2 in mice leads to a cell-autonomous defect and early embryonic lethality. Molecular and Cellular Biology. 23 (3), 908-915 (2003).
- Chua, M. M., et al. CK2 in Cancer: Cellular and Biochemical Mechanisms and Potential Therapeutic Target. Pharmaceuticals (Basel). 10 (1), (2017).
- Tawfic, S., et al. Protein kinase CK2 signal in neoplasia. Histology and Histopathology. 16 (2), 573-582 (2001).
- Hanif, I. M., Hanif, I. M., Shazib, M. A., Ahmad, K. A., Pervaiz, S. Casein Kinase II: an attractive target for anti-cancer drug design. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 42 (10), 1602-1605 (2010).
- Siddiqui-Jain, A., et al. CX-4945, an orally bioavailable selective inhibitor of protein kinase CK2, inhibits prosurvival and angiogenic signaling and exhibits antitumor efficacy. 癌症研究. 70 (24), 10288-10298 (2010).
- Chon, H. J., Bae, K. J., Lee, Y., Kim, J. The casein kinase 2 inhibitor, CX-4945, as an anti-cancer drug in treatment of human hematological malignancies. Frontiers in Pharmacology. 6, 70 (2015).
- Perea, S. E., et al. CIGB-300, a novel proapoptotic peptide that impairs the CK2 phosphorylation and exhibits anticancer properties both in vitro and in vivo. Molecular and Cellular Biochemistry. (1-2), 163-167 (2008).
- Xiao, S., et al. Induced expression of nucleolin phosphorylation-deficient mutant confers dominant-negative effect on cell proliferation. PLoS One. 9 (10), e109858 (2014).
- Shi, Y., Brown, E. D., Walsh, C. T. Expression of recombinant human casein kinase II and recombinant heat shock protein 90 in Escherichia coli and characterization of their interactions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (7), 2767-2771 (1994).
- Mollapour, M., Tsutsumi, S., Kim, Y. S., Trepel, J., Neckers, L. Casein kinase 2 phosphorylation of Hsp90 threonine 22 modulates chaperone function and drug sensitivity. Oncotarget. 2 (5), 407-417 (2011).
- McMillan, E. A., et al. The protein kinase CK2 substrate Jabba modulates lipid metabolism during Drosophila oogenesis. Journal of Biological Chemistry. 293 (8), 2990-3002 (2018).
- Turowec, J. P., et al. Protein kinase CK2 is a constitutively active enzyme that promotes cell survival: strategies to identify CK2 substrates and manipulate its activity in mammalian cells. Methods in Enzymology. , 471-493 (2010).
- Rusin, S. F., Adamo, M. E., Kettenbach, A. N. Identification of Candidate Casein Kinase 2 Substrates in Mitosis by Quantitative Phosphoproteomics. Frontiers in Cell and Developmental Biologyl. 5, 97 (2017).
- Bian, Y., et al. Global screening of CK2 kinase substrates by an integrated phosphoproteomics workflow. Scientific Reports. 3, 3460 (2013).
- Franchin, C., et al. Quantitative analysis of a phosphoproteome readily altered by the protein kinase CK2 inhibitor quinalizarin in HEK-293T cells. Biochimica et Biophysica Acta. 1854 (6), 609-623 (2015).
- Franchin, C., et al. Re-evaluation of protein kinase CK2 pleiotropy: new insights provided by a phosphoproteomics analysis of CK2 knockout cells. Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (11), 2011-2026 (2018).
