Muerte celular anormal es un factor de conducción en muchas enfermedades, incluyendo cáncer, neurodegeneración y tiempos¹. Robustos y sensibles análisis de muerte celular son esenciales para la caracterización de estos trastornos, así como el desarrollo de estrategias terapéuticas para ampliar o reducir la supervivencia celular. Actualmente existen decenas de técnicas para la medición de muerte celular, ya sea directamente o a través de sustituto marcadores². Por ejemplo, la muerte celular puede ser evaluada visualmente con la ayuda de colorantes vitales que tiñe selectivamente las células muertas o vivas³, o mediante el control de la aparición de fosfolípidos específicos en la membrana plasmática^4,5,6 . Mediciones de componentes intracelulares o metabolitos celulares liberados en los medios de comunicación sobre disolución celular también pueden ser utilizadas como sustitutos célula muerte^7,8. Por otra parte, viabilidad celular se puede aproximar mediante la evaluación de la actividad metabólica^9,10. Aunque estos métodos proporcionan medios rápidos de evaluar la supervivencia de la célula, no son sin salvedades. Cada técnica observa la cultura como una sola población, haciendo imposible distinguir entre las células individuales y su ritmo único de supervivencia. Además, estos ensayos poblacionales son incapaces de medir factores que pueden ser importantes para la muerte celular, incluyendo localización, morfología celular y expresión de la proteína. En muchos casos, estos ensayos están limitados a puntos de tiempo discretos y no permiten la observación continua de las células con el tiempo.

En cambio, la microscopía de fluorescencia longitudinal es una metodología altamente flexible que directamente y continuamente monitorea el riesgo de muerte en una sola célula base¹¹. En Resumen, microscopía de fluorescencia longitudinal permite miles de células individuales para realizar un seguimiento a intervalos regulares durante períodos prolongados de tiempo, lo que permite determinaciones precisas de la muerte de las células y los factores que mejoran o inhiben la muerte celular. En su base, el método implica la transfección transitoria o transducción de células con vectores que codifican las proteínas fluorescentes. Luego se establece un único Fiduciario, y la posición de cada célula transfected en relación con este monumento permite al usuario de la imagen y seguir las células individuales en el transcurso de horas, días o semanas. Cuando estas imágenes se ven secuencialmente, la muerte celular se caracteriza por cambios característicos en la fluorescencia, la morfología y la fragmentación del cuerpo de la célula, permitiendo la asignación de un tiempo de la muerte para cada celda. La tasa calculada de la muerte, determinada por la función de riesgo, puede entonces ser cuantitativamente en comparación entre condiciones, o relacionados con seleccionar características celulares usando univariantes o multivariantes de análisis de riesgos proporcionales Cox¹². Juntos, estos métodos permiten la discriminación precisa y objetiva de las tasas de muerte celular en poblaciones celulares y la identificación de las variables que predicen significativamente la muerte celular o supervivencia (figura 1).

Aunque este método puede utilizarse para monitorear la supervivencia en cualquier tipo de poste-mitotic de la célula en una variedad de formatos de la galjanoplastia, este protocolo describe las condiciones de transferencia y proyección de imagen las neuronas corticales de rata cultivadas en una placa de 96 pocillos.