Мониторинг выживаемость нейронов через продольные флуоресцентной микроскопии
Summary
Здесь мы представляем протокол для отслеживания выживания на основе одной ячейки и определения переменных, которые значительно предсказать смерть клетки.
Abstract
Стандартные цитотоксичность анализов, которые требуют сбора лизатов или фиксированные ячейки в нескольких точках времени, имеют ограниченный чувствительность и способность оценить факторы, которые влияют нейрональных судьбы. Эти анализы требуют наблюдения за отдельные популяции клеток в точках дискретного времени. В результате отдельные клетки не могут следовать проспективно со временем, серьезно ограничивая способность различать ли субцеллюлярные события, такие как формирование puncta или белка mislocalization, патогенных драйвера болезни, гомеостатических реакций, или просто случайными явлениями. Одноклеточных продольной микроскопии преодолевает эти ограничения, позволяя исследователя определить различия в выживаемости между населением и привлечь причинно-следственной связи с повышенной чувствительностью. Это видео руководство будет изложить представитель рабочего процесса для экспериментов, измерения одноклеточных выживания крыса первичной корковых нейронов, выражая флуоресцентного белка маркера. Зритель будет узнать, как добиться высокой эффективности transfections, собирать и обрабатывать изображения, включение перспективных отслеживания отдельных ячеек и сравнить относительную выживания нейрональных популяций, с помощью анализа пропорционально опасности Кокс.
Introduction
Клеточная атипия смерть является движущим фактором во многих заболеваний, включая рак, нейродегенеративные и ход1. Надежные и чувствительные анализы для смерти клетки важны для характеристики этих расстройств, а также разработки терапевтических стратегий для расширения или сокращения сотовой выживания. В настоящее время есть множество методов для измерения смерти клетки, либо непосредственно, либо через суррогатные маркеры2. Например смерть клетки можно оценить визуально с помощью жизненно красителей, которые выборочно пятно3живых или мертвых клеток, или путем наблюдения за внешний вид конкретных фосфолипидов на плазматической мембраны4,5,6 . Измерения внутриклеточных компонентов или сотовых метаболитов, выпущенный в СМИ после клеточного распада также может использоваться как прокси для клеток смерть7,8. В качестве альтернативы клеточной жизнеспособности могут быть аппроксимированы оценки метаболической активности9,10. Хотя эти методы обеспечивают быстрое средства оценки выживаемость клеток, они не являются без оговорок. Каждый метод отмечает культуры как одной популяции, делает невозможным провести различие между отдельными клетками и их уникальные показатели выживания. Кроме того такие анализы на основе населения не в состоянии оценить факторы, которые могут быть важными для смерти клетки, в том числе клеточной морфологии, выражение протеина или локализации. Во многих случаях эти анализы ограничены точек дискретного времени и не позволяют для непрерывного наблюдения клеток с течением времени.
В отличие от продольных флуоресцентной микроскопии является весьма гибкой методологии, которая непосредственно и постоянно следит за риск смерти на основе одной ячейки11. Короче говоря продольные флуоресцентной микроскопии позволяет тысячи отдельных ячеек, чтобы быть отслежены на регулярной основе для длительных периодов времени, позволяя точные определения гибель клеток и факторов, которые расширения или подавить смерти клетки. На его базе метод предполагает переходных трансфекции или трансдукции клеток с векторами, кодирование флуоресцентных белков. Затем устанавливается уникальный доверенным лицом, и положение каждой transfected клеток по отношению к этот ориентир позволяет пользователю изображения и отслеживать отдельные ячейки в течение часов, дней или недель. Когда эти изображения просматриваются последовательно, гибель клеток характеризуется характерные изменения флюоресценции, морфология и фрагментации клетки тела, позволяя назначение времени смерти для каждой ячейки. Расчетный уровень смертности, определяется функцией опасности, можно затем количественном сравнении между условиями, или связанных с выбора сотовой характеристик с помощью одномерных или многовариантный Кокс пропорционально опасности анализ12. Вместе эти подходы позволяют точной и объективной дискриминации ставок клеточной смерти среди клеточных популяций, и определения переменных, которые значительно предсказать смерть клетки или выживания (рис. 1).
Хотя этот метод может использоваться для наблюдения за выживание в любой тип клеток после митотическая в различных покрытий форматов, этот протокол будет описывать условия для transfecting и визуализации крыса корковых нейронов, культивируемых в 96-луночных пластине.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь представлены методологии непосредственно следить за выживаемость нейронов на основе одной ячейки. В отличие от традиционных анализов для смерти клетки, которые ограничены для дискретного времени точек и всей популяции клеток, этот метод позволяет для непрерывной оценки различ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Стива Finkbeiner и члены Finkbeiner лаборатории для новаторских роботизированных микроскопии. Мы также благодарим Dan Пейсах за строительство первоначального программного обеспечения для обработки изображений и автоматизированный анализ выживаемости. Эта работа финансировалась Национальный институт неврологических расстройств и инсульта (NINDS) R01-NS097542, Мичиганского университета протеин складные болезни инициативы, и Энн Арбор активных против ALS.
Materials
| Neurobasal Medium | GIBCO | 21103-049 | |
| Opti-MEM | GIBCO | 31985-070 | |
| CompactPrep Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12863 | |
| Magnesium chloride Hexahydrate | Sigma | M9272 | |
| Kynurenic Acid Hydrate | TCI | H0303 | |
| Poly D-Lysine | Millipore | A-003-E | |
| Glutamax | GIBCO | 35050-061 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 52887 | |
| B27 supplement | Thermo Fisher | A3582801 | |
| Penicillin Streptomycin | GIBCO | 15140122 | |
| 96 well plates | TPP | 0876 |
References
- Lockshin, R. A., Zakeri, Z. Cell death in health and disease. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 11, 1214-1224 (2007).
- Kepp, O., Galluzzi, L., Lipinski, M., Yuan, J., Kroemer, G. Cell death assays for drug discovery. Nature Reviews Drug Discovery. 10, 221-237 (2011).
- Lemasters, J. J., et al. The mitochondrial permeability transition in cell death: a common mechanism in necrosis, apoptosis and autophagy. Biochimica et Biophysica Acta Bioenergetics. , 177-196 (1998).
- Vermes, I., Haanen, C., Steffens-Nakken, H., Reutelingsperger, C. A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labelled Annexin V. Journal of Immunological Methods. 184, 39-51 (1995).
- Chien, K. R., Abrams, J., Serroni, A., Martin, J. T., Farber, J. L. Accelerated phospholipid degradation and associated membrane dysfunction in irreversible, ischemic liver cell injury. Journal of Biological Chemistry. 253, 4809-4817 (1978).
- Zwaal, R. F. A., Comfurius, P., Bevers, E. M. Surface exposure of phosphatidylserine in pathological cells. Cell and Molecular Life Sciences. 62, 971-988 (2005).
- Mitchell, D. B., Santone, K. S., Acosta, D. Evaluation of cytotoxicity in cultured cells by enzyme leakage. Journal of Tissue Culture Methods. 6, 113-116 (1980).
- Moran, J. H., Schnellmann, R. G. A rapid beta-NADH-linked fluorescence assay for lactate dehydrogenase in cellular death. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 36, 41-44 (1996).
- Mossman, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: Application to proliferation and cytotoxicity assays. Journal of Immunological Methods. 65 (1-2), 55-63 (1983).
- Guerzoni, L. P. B., et al. In Vitro Modulation of TrkB Receptor Signaling upon Sequential Delivery of Curcumin-DHA Loaded Carriers Towards Promoting Neuronal Survival. Pharmaceutical Research. 34 (2), 492-505 (2017).
- Arrasate, M., Finkbeiner, S. Automated microscope system for determining factors that predict neuronal fate. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 102, 3840-3845 (2005).
- Christensen, E. Multivariate survival analysis using Cox’s regression model. Hepatology. 7, 1346-1358 (1987).
- Barmada, S. J., et al. Autophagy induction enhances TDP43 turnover and survival in neuronal ALS models. Nature Chemical Biology. 10, 677-685 (2014).
- Barmada, S. J., et al. Amelioration of toxicity in neuronal models of amyotrophic lateral sclerosis by hUPF1. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 112, 7821-7826 (2015).
- Malik, A. M., et al. Matrin 3-dependent neurotoxicity is modified by nucleic acid binding and nucleocytoplasmic localization. Elife. 7, (2018).
- Archbold, H. C., et al. TDP43 nuclear export and neurodegeneration in models of amyotrophic lateral sclerosis and frontotemporal dementia. Scientific Reports. 8, 4606 (2018).
- Green, K. M., et al. RAN translation at C9orf72-associated repeat expansions is selectively enhanced by the integrated stress response. Nature Communications. 8, 2005 (2017).
- Park, S. -. K., et al. Overexpression of the essential Sis1 chaperone reduces TDP-43 effects on toxicity and proteolysis. PLOS Genetics. 13, e1006805 (2017).
- Gupta, R., et al. The Proline/Arginine Dipeptide from Hexanucleotide Repeat Expanded C9ORF72 Inhibits the Proteasome. eNeuro. 4, (2017).
- Angelov, B., Angelova, A. Nanoscale clustering of the neurotrophin receptor TrkB revealed by super-resolution STED microscopy. Nanoscale. 9 (28), 9797-9804 (2017).
