Morte celular anormal é um fator determinante em muitas doenças, incluindo câncer, neurodegeneração e derrame¹. Ensaios de robustos e sensíveis para a morte celular são essenciais para a caracterização desses distúrbios, bem como o desenvolvimento de estratégias terapêuticas para estender ou reduzir a sobrevivência celular. Atualmente existem dezenas de técnicas para medir a morte celular, diretamente ou através de de marcadores de substituto². Por exemplo, morte celular pode ser avaliado visualmente com a ajuda de corantes vitais que mancham seletivamente células mortas ou vivas³, ou monitorando o aparecimento de específicos fosfolipídios da membrana plasmática,^4,5,6 . Medições de componentes intracelulares ou metabolitos celulares lançados na mídia sob dissolução celular também podem ser usadas como proxies para célula morte^7,8. Alternativamente, a viabilidade celular pode ser aproximada por avaliar a atividade metabólica^9,10. Embora esses métodos fornecem meios rápidos de avaliação de sobrevivência celular, eles não são sem ressalvas. Cada técnica observa a cultura como uma única população, tornando-se impossível distinguir entre células individuais e as suas taxas únicas de sobrevivência. Além disso, tais ensaios baseados em população são incapazes de medir fatores que podem ser importantes para a morte celular, incluindo a morfologia celular, expressão da proteína ou localização. Em muitos casos, estes ensaios são limitados a pontos de tempo discreto, em não permitem a observação contínua de células ao longo do tempo.

Em contraste, a microscopia de fluorescência longitudinal é uma metodologia altamente flexível que diretamente e continuamente monitora o risco de morte em uma única célula base¹¹. Em breve, a microscopia de fluorescência longitudinal permite que milhares de células individuais a serem controladas em intervalos regulares durante longos períodos de tempo, permitindo que as determinações precisas de morte celular e os fatores que melhorar ou suprimem a morte celular. Em sua base, o método envolve a transfecção transiente ou transdução de células com vetores codificação de proteínas fluorescentes. Um fiduciário exclusivo é então estabelecido, e a posição de cada célula transfectada em relação a este marco permite que o usuário para a imagem e a faixa de células individuais ao longo de horas, dias ou semanas. Quando essas imagens são exibidas em sequência, morte celular é marcado por mudanças características em fluorescência, morfologia e fragmentação do corpo celular, permitindo a atribuição de um tempo de morte para cada célula. A taxa calculada de morte, determinado pela função do perigo, pode então ser quantitativamente comparada entre condições ou relacionada para selecionar características celulares usando univariada ou de análise de riscos proporcionais de Cox multivariada¹². Juntos, essas abordagens permitem a discriminação precisa e objectiva das taxas de morte celular em populações celulares e a identificação das variáveis que predizem significativamente a morte celular e/ou sobrevivência (Figura 1).

Embora esse método pode ser usado para monitorar a sobrevivência em qualquer tipo de célula pós mitóticas em uma variedade de formatos de chapeamento, este protocolo irá descrever condições para transfecting e imaging neurônios corticais de rato cultivados em uma placa de 96 poços.