Monitoraggio di sopravvivenza di un neurone tramite microscopia a fluorescenza longitudinale
Summary
Qui, presentiamo un protocollo per monitorare la sopravvivenza su una base di singola cellula e identificare le variabili che significativamente predicono la morte delle cellule.
Abstract
Saggi di citotossicità standard, che richiedono la raccolta di lisati o celle fisse a più punti di tempo, hanno limitato la sensibilità e la capacità di valutare i fattori che influenzano il destino di un neurone. Queste analisi richiedono l’osservazione di popolazioni separate delle cellule a intervalli di tempo discreti. Di conseguenza, le singole celle non possono essere seguite prospetticamente nel tempo, limitando gravemente la capacità di discriminare se subcellulari eventi, ad esempio puncta formazione o mislocalization di proteine, sono driver patogeni della malattia, le risposte omeostatiche, o fenomeni puramente coincidenti. Cella singola longitudinale microscopia supera queste limitazioni, che permette al ricercatore di determinare le differenze nella sopravvivenza tra popolazioni e disegnare relazioni causali con maggiore sensibilità. Questa video guida illustrerà un flusso di lavoro rappresentativo per gli esperimenti di sopravvivenza unicellulari di primaria neuroni corticali del ratto, che esprime un proteina fluorescente indicatore di misura. Lo spettatore sarà imparare a raggiungere ad alta efficienza transfezioni, raccogliere ed elaborare immagini consentendo il monitoraggio prospettico delle singole celle e confrontare la relativa sopravvivenza di popolazioni neuronali utilizzando analisi rischi proporzionali di Cox.
Introduction
Morte delle cellule anormali è un fattore trainante in molte malattie, compreso cancro, neurodegenerazione e corsa1. Saggi di robuste e sensibile per la morte delle cellule sono essenziali per la caratterizzazione di questi disordini, come pure lo sviluppo di strategie terapeutiche per estendere o ridurre la sopravvivenza cellulare. Attualmente esistono decine di tecniche per la misurazione di morte delle cellule, direttamente o tramite surrogati marcatori2. Ad esempio, morte delle cellule può essere valutata visivamente con l’ausilio di coloranti vitali che macchia selettivamente cellule morte o vita3, o controllando l’aspetto dei fosfolipidi specifici sulla membrana plasmatica4,5,6 . Misure di componenti intracellulari o di metaboliti cellulari rilasciati in media dopo la dissoluzione cellulare utilizzabile anche come proxy per cellule morte7,8. In alternativa, la vitalità cellulare può essere approssimata valutando attività metabolica9,10. Anche se questi metodi forniscono mezzi rapidi di valutare la sopravvivenza delle cellule, non sono senza avvertimenti. Ogni tecnica osserva la cultura come un’unica popolazione, rendendo impossibile distinguere tra le singole celle e loro unici tassi di sopravvivenza. Inoltre, tali dosaggi basati sulla popolazione sono in grado di misurare i fattori che possono essere importanti per la morte delle cellule, compreso la morfologia cellulare, l’espressione della proteina o localizzazione. In molti casi, queste analisi sono limitate ai punti di tempo discreto e non consentono l’osservazione continua delle cellule nel corso del tempo.
Al contrario, microscopia a fluorescenza longitudinale è una metodologia altamente flessibile che direttamente e continuamente controlla il rischio di morte su una singola cellula base11. In breve, microscopia a fluorescenza longitudinale consente a migliaia di singole celle per essere monitorati ad intervalli regolari per lunghi periodi di tempo, consentendo precise determinazioni di morte delle cellule e dei fattori che migliorano o sopprimono la morte delle cellule. Alla sua base, il metodo prevede la trasfezione transiente o trasduzione delle cellule con vettori codificanti proteine fluorescenti. Un unico fiduciario viene quindi stabilito, e la posizione di ogni cellule transfettate in relazione a questa pietra miliare consente all’utente di immagine e tenere traccia di singole cellule nel corso di ore, giorni o settimane. Quando queste immagini vengono visualizzate in sequenza, la morte delle cellule è contrassegnata da cambiamenti caratteristici in fluorescenza, la morfologia e la frammentazione del corpo cellulare, consentendo l’assegnazione di un tempo di morte per ogni cella. Il tasso di morte, determinata dalla funzione di rischio, calcolato può quindi essere quantitativamente rispetto tra le condizioni, o correlato per selezionare caratteristiche cellulari utilizzando monovariante o analisi multivariata rischi proporzionali di Cox12. Insieme, questi approcci consentono la discriminazione accurata e obiettiva dei tassi di morte delle cellule fra popolazioni cellulari e l’identificazione delle variabili che significativamente predicono la morte delle cellule e/o sopravvivenza (Figura 1).
Anche se questo metodo può essere utilizzato per monitorare la sopravvivenza in qualsiasi tipo di cellule post-mitotiche in una varietà di formati di placcatura, questo protocollo descriverà le condizioni per trasfezione e imaging neuroni corticali del ratto coltivati in una piastra a 96 pozzetti.
Protocol
Representative Results
Discussion
Qui, è presentata una metodologia per monitorare direttamente la sopravvivenza di un neurone su base cella singola. Contrariamente ai tradizionali saggi per la morte delle cellule che sono limitati a intervalli di tempo discreti e intere popolazioni delle cellule, questo metodo consente la valutazione continua di una varietà di fattori quali la morfologia cellulare, l’espressione della proteina o localizzazione, e possibile determinare come ciascun fattore influenza la sopravvivenza cellulare in modo prospettico.
<…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Steve Finkbeiner e membri del laboratorio Finkbeiner per pionieristico microscopia robotica. Ringraziamo anche Dan Peisach per costruzione il software iniziale necessaria per elaborazione di immagini e analisi di sopravvivenza automatizzata. Questo lavoro è stato finanziato dall’Istituto nazionale per i disordini neurologici e colpo (NINDS) R01-NS097542, University of Michigan Protein Folding malattia iniziativa e Ann Arbor attivo contro ALS.
Materials
| Neurobasal Medium | GIBCO | 21103-049 | |
| Opti-MEM | GIBCO | 31985-070 | |
| CompactPrep Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12863 | |
| Magnesium chloride Hexahydrate | Sigma | M9272 | |
| Kynurenic Acid Hydrate | TCI | H0303 | |
| Poly D-Lysine | Millipore | A-003-E | |
| Glutamax | GIBCO | 35050-061 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 52887 | |
| B27 supplement | Thermo Fisher | A3582801 | |
| Penicillin Streptomycin | GIBCO | 15140122 | |
| 96 well plates | TPP | 0876 |
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