Summary

ניטור הישרדות עצביים באמצעות מיקרוסקופ פלורסצנטיות האורך

Published: January 19, 2019
doi:

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לפקח על הישרדות על בסיס תא בודד ולזהות משתנים באופן משמעותי לחזות מוות של תאים.

Abstract

מבחני סטנדרט cytotoxicity, אשר דורשים את האוסף של lysates או תאים קבוע בנקודות זמן מרובים, מוגבלת הרגישות ויכולת להעריך גורמים המשפיעים על גורל עצביים. מבחני אלה דורשים התצפית של אוכלוסיות נפרדות של תאים בנקודות זמן בדידים. כתוצאה מכך, תאים בודדים לא יכול להיות במעקב פרוספקטיבי לאורך זמן, מגבילה מאוד את היכולת להבחין בין אם אירועים subcellular, כגון היווצרות puncta או חלבון mislocalization, הם פתוגניים הנהגים של המחלה, תגובות homeostatic, . או תופעות רק צירוף מקרים… מיקרוסקופ האורך תא בודד מתגבר על מגבלות אלו, ומאפשר החוקר לקבוע הבדלים הישרדות בין אוכלוסיות וצייר סיבתי קשרי גומלין עם רגישות משופרת. מדריך וידאו זה מתאר עבודה נציג לניסויים מדידה תא בודד ההישרדות של החולדה הנוירונים קורטיקלית הראשית המבטאת סמן חלבון פלואורסצנטי. הצופה למד כיצד להשיג יעילות גבוהה transfections, לאסוף, לעבד תמונות המאפשר איתור פוטנציאליים של תאים בודדים, ולהשוות את ההישרדות היחסי של אוכלוסיות עצביים באמצעות ניתוח סיכונים ביחס קוקס.

Introduction

מוות של תאים חריגים מהווה גורם המניע במחלות רבות, כולל סרטן, הקשורים ניוון מוחיים של קו1. מבחני רגישות ועמיד עבור מוות תאים חיוניים האפיון של הפרעות אלה, כמו גם הפיתוח של אסטרטגיות טיפוליות תוך הרחבה או צמצום הישרדות הסלולר. כיום יש עשרות טכניקות למדידת מוות של תאים, באופן ישיר או באמצעות פונדקאית סמני2. לדוגמה, מוות של תאים יכולים להידרש באופן חזותי עם העזרה של המשתמשות באופן סלקטיבי כתם תאים מתים או חיים3צבעים חיוני, או על-ידי ניטור את המראה של פוספוליפידים מסוימים קרום פלזמה4,5,6 . מדידות של רכיבים תאיים או הסלולר מטבוליטים שוחרר לתוך כלי התקשורת שנפרעו הסלולר יכול גם לשמש כאל שליחים לתא המוות7,8. לחלופין, הכדאיות הסלולר ניתן לקרב את ערכיהן על-ידי הערכת פעילות חילוף החומרים9,10. למרות ששיטות אלה מספקים אמצעי מהיר הערכת את הישרדות cell, הם לא בלי אזהרות. כל טכניקה מתבונן התרבות כאוכלוסייה אחת, טיוח זה בלתי. אפשרי להבחין בין תאים בודדים שלהם המחירים ייחודי של הישרדות. יתר על כן, מבחני מבוסס-אוכלוסייה כזו אינם יכולים למדוד גורמים שעשויים להיות חשוב עבור מוות של תאים, כולל מורפולוגיה הסלולר, ביטוי חלבונים או לוקליזציה. במקרים רבים, מבחני אלה הן מוגבל לנקודות זמן בדידים, אינם מאפשרים את התצפית רציף של תאים לאורך זמן.

לעומת זאת, מיקרוסקופיה פלורסצנטיות האורך היא מתודולוגיה גמיש במיוחד ישירות ובאופן רצוף מפקח על הסיכון למוות תא בודד בסיס11. בקצרה, מיקרוסקופיה פלורסצנטיות האורך מאפשר אלפי תאים בודדים כדי לאתר במרווחי זמן קבועים לתקופות ממושכות של זמן, ומאפשר האישושים מדויק של מוות של תאים, את הגורמים לשפר או לדכא את מות תאים. בבסיסו, השיטה כוללת של תרביות תאים ארעי או התמרה חושית של תאים עם וקטורים קידוד חלבונים פלורסנט. להחזרי ייחודי אז נוסדה, המיקום של כל תא transfected ביחס ציון זה מאפשר למשתמש תמונה ולעקוב אחר תאים בודדים במשך שעות, ימים או שבועות. כאשר תמונות אלה מוצגים ברצף, מוות של תאים מסומן על ידי שינויים אופייניים פלורסצנטיות, מורפולוגיה, פיצול בגוף התא, המאפשר את ההקצאה של שעת המוות עבור כל תא. הקצב מחושב של מוות, נקבעים על-ידי הפונקציה הזארד, שניתן לאחר מכן באופן כמותי בהשוואה בין תנאי או הקשורים בחר מאפיינים הסלולר באמצעות univariate או רב משתנית קוקס מפגעים פרופורציונלי ניתוח12. יחד, גישות אלה מאפשרים את האפליה מדויק ואובייקטיבי של שערי מוות תאי בקרב אוכלוסיות הסלולר, וזיהוי של משתנים באופן משמעותי לחזות מוות תאי ו/או הישרדות (איור 1).

אמנם ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לעקוב אחר הישרדות בכל סוג התא הפוסט-mitotic במגוון של תבניות ציפוי, פרוטוקול זה יתאר תנאים transfecting, הדמיה החולדה הנוירונים קורטיקלית תרבותי בצלחת 96-ובכן.

Protocol

כל העבודה בעלי חוליות אושרה על ידי הוועדה על שימוש ו טיפול חיות ב אוניברסיטת מישיגן (פרוטוקול # PRO00007096). ניסויים מתוכננים בקפידה כדי למזער את מספר החיות הקריב. בהריון הנשי פראי-סוג (WT), אוונס ארוך שאינו הטרנסגניים חולדות (Rattus norvegicus) שוכנות ביחידים צ’יימברס מצויד עם העשרה סביבתית, המטופלי?…

Representative Results

DIV4 החולדה הנוירונים בקליפת המוח באמצעות ההליך תרביות תאים המתואר כאן, היו transfected עם פלסמיד קידוד מאפל את חלבון פלואורסצנטי. החל 24 שעות שלאחר תרביות תאים, התאים היו עם תמונה על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ כל 24 שעות למשך 10 ימים רצופים. הדימויים הנובעת היו מאורגנים כמצו…

Discussion

כאן מוצגת מתודולוגיה לעקוב ישירות אחר הישרדות העצבית על בסיס תא בודד. בניגוד מבחני מסורתי על מות תאים הנמצאים מוגבל זמן בדידים נקודות ועל אוכלוסיות שלמות של תאים, שיטה זו מאפשרת להערכה מתמשכת של מגוון גורמים כגון מורפולוגיה הסלולר, ביטוי חלבונים או לוקליזציה, ו ניתן לקבוע כיצד כל גורם משפ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

אנו מודים סטיב Finkbeiner וחברי המעבדה Finkbeiner על חלוצית מיקרוסקופ רובוטית. אנו מודים גם דן Peisach לבניה הראשונית התוכנה הדרושות עבור עיבוד תמונה, אוטומטית ניתוח הישרדות. עבודה זו מומן על ידי המכון הלאומי עבור הפרעות נוירולוגיות R01 שבץ (NINDS)-NS097542, אוניברסיטת מישיגן חלבון מתקפלות המחלה יוזמה לבין אן ארבור פעיל נגד ALS.

Materials

Neurobasal Medium GIBCO 21103-049
Opti-MEM GIBCO 31985-070
CompactPrep Plasmid Maxi Kit Qiagen 12863
Magnesium chloride Hexahydrate Sigma M9272
Kynurenic Acid Hydrate TCI H0303
Poly D-Lysine Millipore A-003-E
Glutamax GIBCO 35050-061
Lipofectamine 2000 Invitrogen 52887
B27 supplement Thermo Fisher A3582801
Penicillin Streptomycin GIBCO 15140122
96 well plates TPP 0876

References

  1. Lockshin, R. A., Zakeri, Z. Cell death in health and disease. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 11, 1214-1224 (2007).
  2. Kepp, O., Galluzzi, L., Lipinski, M., Yuan, J., Kroemer, G. Cell death assays for drug discovery. Nature Reviews Drug Discovery. 10, 221-237 (2011).
  3. Lemasters, J. J., et al. The mitochondrial permeability transition in cell death: a common mechanism in necrosis, apoptosis and autophagy. Biochimica et Biophysica Acta Bioenergetics. , 177-196 (1998).
  4. Vermes, I., Haanen, C., Steffens-Nakken, H., Reutelingsperger, C. A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labelled Annexin V. Journal of Immunological Methods. 184, 39-51 (1995).
  5. Chien, K. R., Abrams, J., Serroni, A., Martin, J. T., Farber, J. L. Accelerated phospholipid degradation and associated membrane dysfunction in irreversible, ischemic liver cell injury. Journal of Biological Chemistry. 253, 4809-4817 (1978).
  6. Zwaal, R. F. A., Comfurius, P., Bevers, E. M. Surface exposure of phosphatidylserine in pathological cells. Cell and Molecular Life Sciences. 62, 971-988 (2005).
  7. Mitchell, D. B., Santone, K. S., Acosta, D. Evaluation of cytotoxicity in cultured cells by enzyme leakage. Journal of Tissue Culture Methods. 6, 113-116 (1980).
  8. Moran, J. H., Schnellmann, R. G. A rapid beta-NADH-linked fluorescence assay for lactate dehydrogenase in cellular death. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 36, 41-44 (1996).
  9. Mossman, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: Application to proliferation and cytotoxicity assays. Journal of Immunological Methods. 65 (1-2), 55-63 (1983).
  10. Guerzoni, L. P. B., et al. In Vitro Modulation of TrkB Receptor Signaling upon Sequential Delivery of Curcumin-DHA Loaded Carriers Towards Promoting Neuronal Survival. Pharmaceutical Research. 34 (2), 492-505 (2017).
  11. Arrasate, M., Finkbeiner, S. Automated microscope system for determining factors that predict neuronal fate. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 102, 3840-3845 (2005).
  12. Christensen, E. Multivariate survival analysis using Cox’s regression model. Hepatology. 7, 1346-1358 (1987).
  13. Barmada, S. J., et al. Autophagy induction enhances TDP43 turnover and survival in neuronal ALS models. Nature Chemical Biology. 10, 677-685 (2014).
  14. Barmada, S. J., et al. Amelioration of toxicity in neuronal models of amyotrophic lateral sclerosis by hUPF1. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 112, 7821-7826 (2015).
  15. Malik, A. M., et al. Matrin 3-dependent neurotoxicity is modified by nucleic acid binding and nucleocytoplasmic localization. Elife. 7, (2018).
  16. Archbold, H. C., et al. TDP43 nuclear export and neurodegeneration in models of amyotrophic lateral sclerosis and frontotemporal dementia. Scientific Reports. 8, 4606 (2018).
  17. Green, K. M., et al. RAN translation at C9orf72-associated repeat expansions is selectively enhanced by the integrated stress response. Nature Communications. 8, 2005 (2017).
  18. Park, S. -. K., et al. Overexpression of the essential Sis1 chaperone reduces TDP-43 effects on toxicity and proteolysis. PLOS Genetics. 13, e1006805 (2017).
  19. Gupta, R., et al. The Proline/Arginine Dipeptide from Hexanucleotide Repeat Expanded C9ORF72 Inhibits the Proteasome. eNeuro. 4, (2017).
  20. Angelov, B., Angelova, A. Nanoscale clustering of the neurotrophin receptor TrkB revealed by super-resolution STED microscopy. Nanoscale. 9 (28), 9797-9804 (2017).
check_url/cn/59036?article_type=t

Play Video

Cite This Article
Weskamp, K., Safren, N., Miguez, R., Barmada, S. Monitoring Neuronal Survival via Longitudinal Fluorescence Microscopy. J. Vis. Exp. (143), e59036, doi:10.3791/59036 (2019).

View Video