La mort des cellules anormales est un facteur déterminant dans de nombreuses maladies, y compris le cancer, neurodégénérescence et course¹. Les dosages robustes et sensibles pour la mort des cellules sont essentielles pour la caractérisation de ces troubles, ainsi que le développement de stratégies thérapeutiques pour étendre ou réduire la survie cellulaire. Il y a actuellement des dizaines de techniques pour mesurer la mort cellulaire, soit directement, soit par le biais de substitution des marqueurs². Par exemple, la mort cellulaire peut être évaluée visuellement à l’aide de colorants vitaux qui tachent sélectivement les cellules mortes ou vivantes,³, ou en surveillant l’apparition des phospholipides spécifiques sur la membrane plasmique^4,,^5,6 . Mesures des composants intracellulaires ou des métabolites cellulaires rejetés dans les médias à la dissolution cellulaire peuvent également servir de proxies pour cellule mort^7,8. Alternativement, la viabilité cellulaire peut être approchée en évaluant l’activité métabolique^9,10. Bien que ces méthodes fournissent des moyens rapides d’évaluation de la survie cellulaire, ils ne sont pas sans réserves. Chaque technique relève de la culture comme une seule population, rendant impossible de distinguer les cellules individuelles et leurs tarifs uniques de survie. En outre, ces tests sur la population sont incapables de mesurer les facteurs qui peuvent être importants pour la mort de cellules, y compris la morphologie cellulaire, expression de la protéine ou la localisation. Dans de nombreux cas, ces tests sont limitées aux points de temps discret et ne permettent pas l’observation continue des cellules au fil du temps.

En revanche, microscopie de fluorescence longitudinale est une méthodologie très flexible qui directement et en permanence surveille le risque de décès sur une seule cellule base¹¹. En bref, microscopie de fluorescence longitudinale permet à des milliers de cellules individuelles pour être suivis à intervalles réguliers pendant de longues périodes de temps, permettant à des déterminations précises de mort cellulaire et les facteurs qui favorisent ou suppriment la mort cellulaire. À sa base, la méthode implique la transfection transitoire ou la transduction des cellules avec des vecteurs codant des protéines fluorescentes. Un fiduciaire unique est alors établi, et la position de chaque cellules transfectées par rapport à ce point de repère permet à l’utilisateur de l’image et de suivre les cellules individuelles au cours des heures, jours ou semaines. Lorsque ces images sont affichés dans l’ordre, la mort cellulaire est marquée par des modifications caractéristiques en fluorescence, la morphologie et la fragmentation du corps cellulaire, permettant l’attribution d’un temps mort pour chaque cellule. Le taux calculé de la mort, déterminé par la fonction de risque, peut ensuite être quantitativement comparé entre les conditions, ou associé à sélectionner des caractéristiques cellulaires utilisant univariée ou multivariée Cox hasards proportionnels analyse¹². Ensemble, ces approches permettent la discrimination précise et objective du taux de mort cellulaire chez les populations cellulaires et l’identification des variables qui permettent de prédire significativement la mort cellulaire et/ou de survie (Figure 1).

Bien que cette méthode peut être utilisée pour surveiller la survie dans n’importe quel type de cellules post-mitotiques dans une variété de formats de placage, ce protocole décrira les conditions pour transfectants et l’imagerie des neurones corticaux rat cultivées dans une plaque à 96 puits.