Abnormale celdood is een drijvende factor in vele ziekten, waaronder kanker, neurodegeneratie en lijn¹. Robuust en gevoelige testen voor de dood van de cel zijn essentieel voor de karakterisatie van deze aandoeningen, evenals de ontwikkeling van therapeutische strategieën tot verlenging of vermindering van de cellulaire overleven. Er zijn momenteel tientallen technieken voor het meten van celdood, ofwel rechtstreeks ofwel via surrogaat markeringen². Bijvoorbeeld, kan celdood visueel worden beoordeeld met behulp van vitale kleurstoffen die selectief vlek dode of levende cellen³, of door de controle van het uiterlijk van specifieke fosfolipiden op het plasmamembraan^4,5,6 . Metingen van intracellulaire componenten of cellulaire metabolieten vrijkomen van de media bij cellulaire ontbinding kunnen ook worden gebruikt als proxy’s voor^7,8van de dood van de cel. U kunt ook kan cellulaire levensvatbaarheid worden benaderd door metabole activiteit^9,10te beoordelen. Al deze methoden snelle middel om de beoordeling overleving van de cel bieden, zijn zij niet zonder voorbehoud. Elke techniek merkt de cultuur als een enkele populatie, waardoor het onmogelijk is om te onderscheiden tussen afzonderlijke cellen en hun unieke tarieven van overleving. Bovendien zijn deze gehaltebepalingen bevolking gebaseerde kunnen factoren die belangrijk voor de dood van de cel zijn kunnen, met inbegrip van cellulaire morfologie, eiwit expressie of lokalisatie gemeten. In veel gevallen, deze tests zijn beperkt tot discrete tijd punten, en sta niet voor de continue waarneming van cellen na verloop van tijd.

In tegenstelling, is longitudinale fluorescentie microscopie een zeer flexibele methodologie die rechtstreeks en continu het risico van overlijden op een eencellige basis^{11 monitoren}. Kortom, kunt longitudinale fluorescentie microscopie duizenden afzonderlijke cellen worden bijgehouden op regelmatige tijdstippen gedurende langere perioden van tijd, waardoor nauwkeurige metingen van celdood en de factoren die het versterken of onderdrukken van celdood. Aan de basis wordt bij deze methode de voorbijgaande transfectie of signaaltransductie van cellen met vectoren codering van fluorescente proteïnen. Een unieke fiduciaire is dan vastgesteld en de positie van elke transfected cel met betrekking tot deze mijlpaal kan de gebruiker image & bijhouden van afzonderlijke cellen in de loop van uren, dagen of weken. Als deze beelden opeenvolgend worden weergegeven, wordt celdood gekenmerkt door karakteristieke wijzigingen in fluorescentie, morfologie en versnippering van het lichaam van de cel, waardoor de toewijzing van een moment van overlijden voor elke cel. Het berekende percentage van de dood, bepaald door de gevaar-functie, kan vervolgens worden kwantitatief vergeleken tussen voorwaarden, of aan het selecteren van cellulaire kenmerken met behulp van univariate of multivariate Cox proportionele gevaren analyse¹²gerelateerde. Deze benaderingen kunnen samen de correcte en objectieve discriminatie van tarieven van celdood onder mobiele bevolkingsgroepen, en de identificatie van variabelen die aanzienlijk celdood en/of survival (Figuur 1 voorspellen).

Hoewel deze methode kan worden gebruikt om te overleven in een post mitotische celtype in een verscheidenheid van formaten plating controleren, zal dit protocol voorwaarden voor transfecting en corticale neuronen rat gekweekt in een 96-wells-plaat imaging beschrijven.