Overvågning Neuronal overlevelse via langsgående Fluorescens mikroskopi
Summary
Vi præsenterer her, en protokol for at overvåge overlevelse på grundlag af enkelt celle og identificere variabler, der væsentligt forudser celledød.
Abstract
Standard celletoksicitet assays, som kræver indsamling af lysates eller fast celler på flere tidspunkter, har begrænset følsomhed og evne til at vurdere faktorer, der påvirker neuronal skæbne. Disse assays kræver observation af adskilte populationer af celler i diskret tidspunkter. Som et resultat, kan ikke individuelle celler fulgt prospektivt over tid, alvorligt begrænser evne til at skelne om subcellulært begivenheder, såsom puncta dannelse eller protein mislocalization, er patogene førere af sygdom, homeostatiske svar, eller blot tilfældigt fænomener. Encellede langsgående mikroskopi overvinder disse begrænsninger, så forskeren til at bestemme forskellene i overlevelse mellem befolkninger og drage årsagssammenhænge med øget følsomhed. Denne video guide vil skitsere en repræsentativ arbejdsproces for eksperimenter måling encellede overlevelse af rotte primære kortikale neuroner at udtrykke en fluorescerende proteiner markør. Seeren vil lære at opnå høj effektivitet transfections, indsamle og behandle billeder gør det muligt for potentielle sporingen af individuelle celler, og sammenligne den relative overlevelse af neuronal befolkninger ved hjælp af Cox proportional farer analyse.
Introduction
Unormal celledød er en drivende faktor i mange sygdomme, herunder kræft, neurodegeneration og slagtilfælde1. Robust og følsom assays til celledød er afgørende for karakterisering af disse lidelser, samt udviklingen af terapeutiske strategier til udvidelse eller indskrænkning cellulære overlevelse. Der er i øjeblikket snesevis af teknikker til at måle celledød, enten direkte eller gennem surrogat markører2. For eksempel, kan celledød vurderes visuelt ved hjælp af vitale farvestoffer, der selektivt pletter døde eller levende celler3, eller ved at overvåge forekomsten af specifikke fosfolipider på plasma membran4,5,6 . Målinger af intracellulære komponenter eller cellulære metabolitter frigives i medierne på cellulære opløsning kan også bruges som proxies for celle død7,8. Alternativt, cellulære levedygtighed kan estimeres ved at vurdere metaboliske aktivitet9,10. Selv om disse metoder giver hurtig vurdering af celle overlevelse, er de ikke uden forbehold. Hver teknik bemærker kulturen som en enkelt population, gør det umuligt at skelne mellem enkelte celler og deres unikke satser for overlevelse. Desuden er sådan befolkningsbaseret assays ude af stand til at måle faktorer, der kan være vigtige for celledød, herunder cellulære morfologi, protein udtryk eller lokalisering. I mange tilfælde disse assays er begrænset til diskret tid point, og giver mulighed ikke for kontinuerlig observation af celler over tid.
Derimod er langsgående Fluorescens mikroskopi en yderst fleksibel metode, der direkte og løbende overvåger risikoen for død på en enkelt celle grundlag11. Kort sagt, giver langsgående Fluorescens mikroskopi tusindvis af individuelle celler kan spores med jævne mellemrum i længere tid, giver mulighed for præcis bestemmelse af celledød og de faktorer, der øger eller undertrykke celledød. På sin base indebærer metoden forbigående Transfektion eller transduktion af celler med vektorer kodning fluorescerende proteiner. En unik fiduciary oprettes derefter, og placeringen af hver transfected celle i forhold til denne skelsættende tillader brugeren at billede og spore individuelle celler i løbet af timer, dage eller uger. Når disse billeder vises sekventielt, er celledød præget af karakteristiske ændringer i fluorescens, morfologi og fragmentering af cellen kroppen, gør det muligt for tildelingen af en dødstidspunktet for hver celle. Den beregnede sats af død, bestemmes af funktionen fare kan derefter kvantitativt i forhold mellem betingelser, eller relateret til Vælg cellulære karakteristika ved hjælp af inputområdet eller flerdimensional Cox proportional farer analyse12. Sammen, aktiverer disse tilgange den præcise og objektive forskelsbehandling af satserne for celledød blandt cellulære populationer, og identifikation af variabler, der væsentligt forudser celledød og/eller overlevelse (figur 1).
Selv om denne metode kan bruges til at overvåge overlevelse i enhver post mitotiske celletype i en række fra plating formater, vil denne protokol beskriver betingelserne for transfecting og imaging rotte kortikale neuroner kulturperler i en 96-brønd plade.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her præsenteres metode til direkte overvågning af neuronal overlevelse på grundlag af enkelt celle. I modsætning til traditionelle assays til celledød, der er begrænset til diskret tid point og hele populationer af celler, denne metode giver mulighed for kontinuerlig vurdering af en række faktorer såsom cellulære morfologi, protein udtryk eller lokalisering, og kan bestemme, hvordan hver faktor påvirker cellulære overlevelse i en fremadrettet måde.
Denne metode kan ændres så det …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Steve Finkbeiner og medlemmer af Finkbeiner lab for banebrydende robot mikroskopi. Vi takker også Dan Peisach for bygning, den oprindelige software kræves til billedbehandling og automatiseret overlevelses analyse. Dette arbejde blev finansieret af National Institute for neurologiske lidelser og slagtilfælde (NINDS) R01-NS097542, University of Michigan Protein Folding sygdom initiativ og Ann Arbor aktivt mod ALS.
Materials
| Neurobasal Medium | GIBCO | 21103-049 | |
| Opti-MEM | GIBCO | 31985-070 | |
| CompactPrep Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12863 | |
| Magnesium chloride Hexahydrate | Sigma | M9272 | |
| Kynurenic Acid Hydrate | TCI | H0303 | |
| Poly D-Lysine | Millipore | A-003-E | |
| Glutamax | GIBCO | 35050-061 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 52887 | |
| B27 supplement | Thermo Fisher | A3582801 | |
| Penicillin Streptomycin | GIBCO | 15140122 | |
| 96 well plates | TPP | 0876 |
References
- Lockshin, R. A., Zakeri, Z. Cell death in health and disease. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 11, 1214-1224 (2007).
- Kepp, O., Galluzzi, L., Lipinski, M., Yuan, J., Kroemer, G. Cell death assays for drug discovery. Nature Reviews Drug Discovery. 10, 221-237 (2011).
- Lemasters, J. J., et al. The mitochondrial permeability transition in cell death: a common mechanism in necrosis, apoptosis and autophagy. Biochimica et Biophysica Acta Bioenergetics. , 177-196 (1998).
- Vermes, I., Haanen, C., Steffens-Nakken, H., Reutelingsperger, C. A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labelled Annexin V. Journal of Immunological Methods. 184, 39-51 (1995).
- Chien, K. R., Abrams, J., Serroni, A., Martin, J. T., Farber, J. L. Accelerated phospholipid degradation and associated membrane dysfunction in irreversible, ischemic liver cell injury. Journal of Biological Chemistry. 253, 4809-4817 (1978).
- Zwaal, R. F. A., Comfurius, P., Bevers, E. M. Surface exposure of phosphatidylserine in pathological cells. Cell and Molecular Life Sciences. 62, 971-988 (2005).
- Mitchell, D. B., Santone, K. S., Acosta, D. Evaluation of cytotoxicity in cultured cells by enzyme leakage. Journal of Tissue Culture Methods. 6, 113-116 (1980).
- Moran, J. H., Schnellmann, R. G. A rapid beta-NADH-linked fluorescence assay for lactate dehydrogenase in cellular death. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 36, 41-44 (1996).
- Mossman, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: Application to proliferation and cytotoxicity assays. Journal of Immunological Methods. 65 (1-2), 55-63 (1983).
- Guerzoni, L. P. B., et al. In Vitro Modulation of TrkB Receptor Signaling upon Sequential Delivery of Curcumin-DHA Loaded Carriers Towards Promoting Neuronal Survival. Pharmaceutical Research. 34 (2), 492-505 (2017).
- Arrasate, M., Finkbeiner, S. Automated microscope system for determining factors that predict neuronal fate. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 102, 3840-3845 (2005).
- Christensen, E. Multivariate survival analysis using Cox’s regression model. Hepatology. 7, 1346-1358 (1987).
- Barmada, S. J., et al. Autophagy induction enhances TDP43 turnover and survival in neuronal ALS models. Nature Chemical Biology. 10, 677-685 (2014).
- Barmada, S. J., et al. Amelioration of toxicity in neuronal models of amyotrophic lateral sclerosis by hUPF1. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 112, 7821-7826 (2015).
- Malik, A. M., et al. Matrin 3-dependent neurotoxicity is modified by nucleic acid binding and nucleocytoplasmic localization. Elife. 7, (2018).
- Archbold, H. C., et al. TDP43 nuclear export and neurodegeneration in models of amyotrophic lateral sclerosis and frontotemporal dementia. Scientific Reports. 8, 4606 (2018).
- Green, K. M., et al. RAN translation at C9orf72-associated repeat expansions is selectively enhanced by the integrated stress response. Nature Communications. 8, 2005 (2017).
- Park, S. -. K., et al. Overexpression of the essential Sis1 chaperone reduces TDP-43 effects on toxicity and proteolysis. PLOS Genetics. 13, e1006805 (2017).
- Gupta, R., et al. The Proline/Arginine Dipeptide from Hexanucleotide Repeat Expanded C9ORF72 Inhibits the Proteasome. eNeuro. 4, (2017).
- Angelov, B., Angelova, A. Nanoscale clustering of the neurotrophin receptor TrkB revealed by super-resolution STED microscopy. Nanoscale. 9 (28), 9797-9804 (2017).
