通过纵向荧光显微镜监测新生儿生存
Summary
在这里, 我们提出了一个协议, 在单细胞的基础上监测生存情况, 并确定显著预测细胞死亡的变量。
Abstract
标准的细胞毒性检测, 需要收集裂解液或固定细胞在多个时间点, 有有限的敏感性和能力来评估影响神经元的命运因素。这些检测需要观察离散时间点的单独细胞群。因此, 随着时间的推移, 单个细胞不能前瞻性地跟踪, 严重限制了区分亚细胞事件 (如点状形成或蛋白质定位不当) 是否为疾病的致病性驱动因素、稳态反应的能力,或仅仅是巧合的现象。单细胞纵向显微镜克服了这些限制, 使研究人员能够确定种群之间的生存差异, 并以更高的灵敏度得出因果关系。本视频指南将概述一个具有代表性的工作流程, 用于测量表达荧光蛋白标记的大鼠原代皮质神经元单细胞存活情况的实验。观众将学习如何实现高效的转化, 收集和处理图像, 使单个细胞的前瞻性跟踪, 并使用 cox 比例危害分析比较神经元群的相对生存。
Introduction
异常细胞死亡是许多疾病的驱动因素, 包括癌症、神经退行性变和中风1。对细胞死亡进行可靠和敏感的检测对于这些疾病的描述以及扩大或降低细胞存活率的治疗策略的发展至关重要。目前有几十种技术可以直接或通过代理标记2测量细胞死亡。例如, 可以通过选择性染色死细胞或活细胞3的重要染料, 或通过监测血浆膜 4,5, 6上特定磷脂的外观, 从视觉上评估细胞死亡情况..细胞内成分或细胞代谢物在细胞溶解时释放到培养基中的测量也可用作细胞死亡的代名词 7,8。或者, 细胞活力可以通过评估代谢活动9,10近似。尽管这些方法提供了评估细胞存活的快速方法, 但它们并非没有警告。每种技术都将培养作为一个单一的群体来观察, 因此不可能区分单个细胞及其独特的存活率。此外, 这种基于人群的检测无法衡量可能对细胞死亡很重要的因素, 包括细胞形态、蛋白质表达或定位。在许多情况下, 这些检测仅限于离散的时间点, 不允许随着时间的推移对细胞进行连续观察。
相反, 纵向荧光显微镜是一种高度灵活的方法, 可在单细胞基础上直接和持续地监测死亡风险11。简单地说, 纵向荧光显微镜可以对数千个单个细胞进行长时间的跟踪, 从而精确地确定细胞死亡和增强或抑制细胞死亡的因素。在其基础上, 该方法涉及瞬态转染或转导细胞与矢量编码荧光蛋白。然后建立一个独特的信托, 每个转染细胞相对于这个地标的位置允许用户在几个小时、几天或几周的时间里对单个细胞进行成像和跟踪。当按顺序查看这些图像时, 细胞死亡的特征变化是细胞体的荧光、形态和碎片, 从而能够为每个细胞分配死亡时间。计算出的死亡率, 由危险函数确定, 然后可以定量比较条件之间, 或有关选择细胞特征使用单变量或多变量 cox 比例危害分析12。这些方法结合在一起, 可以准确和客观地识别细胞种群中的细胞死亡率, 并识别显著预测细胞死亡和存活的变量 (图 1)。
虽然这种方法可用于监测任何有丝分裂后细胞类型的存活在各种电镀格式, 该协议将描述条件转染和成像大鼠皮质神经元培养在96孔板。
Protocol
Representative Results
Discussion
本文提出了在单细胞基础上直接监测神经元存活的方法。与传统的细胞死亡检测仅限于离散时间点和整个细胞群相比, 这种方法允许对多种因素进行持续评估, 如细胞形态、蛋白质表达或定位, 以及可以确定每个因素如何以一种前瞻性的方式影响细胞的存活。
这种方法可以修改, 以适应广泛的实验需求。成像的频率和持续时间可以很容易地调整, 任何感兴趣的蛋白质都可以与荧?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢 steve finkbeiner 和 finkbeiner 实验室的成员, 感谢他们的开创性机器人显微镜。我们还感谢 dan peisach 构建了图像处理和自动生存分析所需的初始软件。这项工作是由国家神经疾病和中风研究所 (ninsds) r01-ns097542, 密歇根大学蛋白质折叠疾病倡议, 安阿伯积极反对 als 资助。
Materials
| Neurobasal Medium | GIBCO | 21103-049 | |
| Opti-MEM | GIBCO | 31985-070 | |
| CompactPrep Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12863 | |
| Magnesium chloride Hexahydrate | Sigma | M9272 | |
| Kynurenic Acid Hydrate | TCI | H0303 | |
| Poly D-Lysine | Millipore | A-003-E | |
| Glutamax | GIBCO | 35050-061 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 52887 | |
| B27 supplement | Thermo Fisher | A3582801 | |
| Penicillin Streptomycin | GIBCO | 15140122 | |
| 96 well plates | TPP | 0876 |
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