رصد بقاء الخلايا العصبية عن طريق الفحص المجهري Fluorescence طولية
Summary
نقدم هنا، بروتوكولا لرصد البقاء على قيد الحياة على أساس خلية واحدة وتحديد المتغيرات التي كثيرا التنبؤ بموت الخلايا.
Abstract
فحوصات سيتوتوكسيسيتي القياسية، التي تتطلب جمع ليساتيس أو الخلايا الثابتة في نقاط زمنية متعددة، حدت من الحساسية والقدرة على تقييم العوامل التي تؤثر على مصير الخلايا العصبية. وتتطلب هذه الاختبارات مراقبة السكان منفصلة من الخلايا عند نقاط زمنية منفصلة. كنتيجة لذلك، لا يمكن أن يتبع الخلايا الفردية مستقبلي مع مرور الوقت، الحد من شدة القدرة على تميز ما إذا كانت الأحداث سوبسيلولار، مثل تشكيل بونكتا أو ميسلوكاليزيشن البروتين، السائقين المسببة للمرض، وردود التماثل الساكن، أو الظواهر مجرد مصادفة. خلية واحدة طولية الفحص المجهري يتغلب على هذه القيود، يسمح للباحث تحديد الاختلافات في البقاء على قيد الحياة بين السكان ورسم العلاقات السببية مع زيادة حساسية. وسيتناول هذا الفيديو دليل سير عمل ممثل لتجارب قياس بقاء خلية واحدة من الفئران الخلايا العصبية القشرية الأولية معربا عن علامة نيون بروتين. المشاهد سوف تعلم كيفية تحقيق ترانسفيكشنز ذات الكفاءة العالية، وجمع ومعالجة الصور يتيح تتبع المحتملين من خلايا فردية، وقارن النسبي بقاء السكان الخلايا العصبية باستخدام تحليل المخاطر النسبية كوكس.
Introduction
موت الخلايا غير طبيعية عامل قيادة في العديد من الأمراض، بما في ذلك السرطان، نيوروديجينيريشن، والسكتة الدماغية1. فحوصات قوية وحساسة لموت الخلية ضرورية لتوصيف هذه الاضطرابات، فضلا عن وضع استراتيجيات علاجية لتمديد أو تقليص الخلوية البقاء على قيد الحياة. لا يوجد حاليا عشرات من أساليب لقياس موت الخلية، أما مباشرة أو من خلال علامات البديل2. على سبيل المثال، يمكن تقييم موت الخلية بصريا مع المساعدة من الأصباغ الحيوية التي وصمة بشكل انتقائي خلايا ميتة أو حية3، أو عن طريق رصد مظهر فوسفوليبيدات محددة على غشاء البلازما4،5،6 . يمكن أيضا استخدام القياسات للمكونات داخل الخلايا أو نواتج الأيض الخلوية تسربها إلى وسائل الإعلام عند انحلال الخلوية كوكلاء للخلية وفاة7،8. وبدلاً من ذلك، يمكن تقريبها صلاحية الخلوية بتقييم النشاط الأيضي9،10. على الرغم من أن هذه الأساليب توفير وسائل سريعة لتقييم بقاء الخلية، فليست دون محاذير. ويلاحظ كل تقنية الثقافة السكان واحدة، مما يجعل من المستحيل التمييز بين خلايا فردية وفريدة من نوعها معدلات البقاء على قيد الحياة. وعلاوة على ذلك، هذه الاختبارات المستندة إلى السكان غير قادر على قياس العوامل التي قد تكون هامة لموت الخلايا، بما في ذلك مورفولوجيا الخلوية أو تعبير البروتين أو التعريب. في كثير من الحالات، هذه فحوصات تقتصر على النقاط الزمنية المنفصلة، ولا تسمح للمراقبة المستمرة للخلايا على مر الزمن.
وفي المقابل، مجهرية الفلورية الطولية هو منهجية مرنة للغاية التي ترصد مباشرة واستمرار خطر الوفاة على أساس خلية واحدة11. وباختصار، مجهرية الفلورية الطولية تمكن آلاف خلايا الفردية لتعقب على فترات منتظمة لفترات طويلة من الزمن، والسماح بتحديدات دقيقة لموت الخلايا والعوامل التي تعزز أو منع موت الخلايا. عند قاعدته، ينطوي الأسلوب تعداء عابرة أو توصيل الخلايا مع ناقلات ترميز البروتينات الفلورية. ثم ينشأ من fiduciary فريدة من نوعها، وموضع كل الخلية transfected فيما يتعلق بهذا المعلم يسمح للمستخدم بالصورة، وتعقب الخلايا الفردية على مدى ساعات أو أيام أو أسابيع. عندما ينظر إلى هذه الصور تسلسلياً، موت الخلية يتسم بالتغيرات المميزة في الأسفار ومورفولوجيا وتجزؤ الجسم الخلية، مما يتيح تخصيص وقت الوفاة لكل خلية. معدل الوفيات، تحدد بواسطة الدالة المخاطر المحسوبة يمكن ثم كمياً مقارنة بين الشروط، أو تتصل بتحديد الخصائص الخلوية باستخدام وحيد المتغير أو المتغيرات تحليل المخاطر النسبية كوكس12. معا، تمكين هذه النهج بالتمييز دقيقة وموضوعية لمعدلات موت الخلية بين السكان الخلوية، وتحديد المتغيرات التي تنبئ بشكل ملحوظ موت الخلية و/أو البقاء على قيد الحياة (الشكل 1).
على الرغم من أن يمكن استخدام هذا الأسلوب لرصد البقاء على قيد الحياة في أي نوع الخلية بعد الانقسامية في مجموعة متنوعة من تنسيقات الطلاء، سيصف هذا البروتوكول شروط ترانسفيكتينج وتصوير الخلايا العصبية القشرية الفئران مثقف في صفيحة 96-جيدا.
Protocol
Representative Results
Discussion
ويرد هنا، منهجية لرصد مباشرة بقاء الخلايا العصبية على أساس خلية واحدة. على عكس الاختبارات التقليدية لموت الخلايا التي تقتصر على النقاط الزمنية المنفصلة ومجموعات سكانية بأكملها من الخلايا، يسمح هذا الأسلوب للتقييم المستمر لمجموعة متنوعة من العوامل مثل مورفولوجيا الخلوية أو تعبير البروت…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن نشكر ستيف فينكبينر وأعضاء في مختبر فينكبينر للرائد مجهرية الروبوتية. ونشكر أيضا دان بيساتش لبناء البرمجيات الأولية اللازمة لمعالجة الصور والآلي تحليل البقاء على قيد الحياة. تم تمويل هذا العمل من قبل المعهد الوطني للاضطرابات العصبية و “السكتة الدماغية” (NINDS) R01-NS097542، جامعة ميشيغان البروتين للطي المرض المبادرة، وأن أربور نشطة ضد المرض.
Materials
| Neurobasal Medium | GIBCO | 21103-049 | |
| Opti-MEM | GIBCO | 31985-070 | |
| CompactPrep Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12863 | |
| Magnesium chloride Hexahydrate | Sigma | M9272 | |
| Kynurenic Acid Hydrate | TCI | H0303 | |
| Poly D-Lysine | Millipore | A-003-E | |
| Glutamax | GIBCO | 35050-061 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 52887 | |
| B27 supplement | Thermo Fisher | A3582801 | |
| Penicillin Streptomycin | GIBCO | 15140122 | |
| 96 well plates | TPP | 0876 |
References
- Lockshin, R. A., Zakeri, Z. Cell death in health and disease. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 11, 1214-1224 (2007).
- Kepp, O., Galluzzi, L., Lipinski, M., Yuan, J., Kroemer, G. Cell death assays for drug discovery. Nature Reviews Drug Discovery. 10, 221-237 (2011).
- Lemasters, J. J., et al. The mitochondrial permeability transition in cell death: a common mechanism in necrosis, apoptosis and autophagy. Biochimica et Biophysica Acta Bioenergetics. , 177-196 (1998).
- Vermes, I., Haanen, C., Steffens-Nakken, H., Reutelingsperger, C. A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labelled Annexin V. Journal of Immunological Methods. 184, 39-51 (1995).
- Chien, K. R., Abrams, J., Serroni, A., Martin, J. T., Farber, J. L. Accelerated phospholipid degradation and associated membrane dysfunction in irreversible, ischemic liver cell injury. Journal of Biological Chemistry. 253, 4809-4817 (1978).
- Zwaal, R. F. A., Comfurius, P., Bevers, E. M. Surface exposure of phosphatidylserine in pathological cells. Cell and Molecular Life Sciences. 62, 971-988 (2005).
- Mitchell, D. B., Santone, K. S., Acosta, D. Evaluation of cytotoxicity in cultured cells by enzyme leakage. Journal of Tissue Culture Methods. 6, 113-116 (1980).
- Moran, J. H., Schnellmann, R. G. A rapid beta-NADH-linked fluorescence assay for lactate dehydrogenase in cellular death. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 36, 41-44 (1996).
- Mossman, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: Application to proliferation and cytotoxicity assays. Journal of Immunological Methods. 65 (1-2), 55-63 (1983).
- Guerzoni, L. P. B., et al. In Vitro Modulation of TrkB Receptor Signaling upon Sequential Delivery of Curcumin-DHA Loaded Carriers Towards Promoting Neuronal Survival. Pharmaceutical Research. 34 (2), 492-505 (2017).
- Arrasate, M., Finkbeiner, S. Automated microscope system for determining factors that predict neuronal fate. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 102, 3840-3845 (2005).
- Christensen, E. Multivariate survival analysis using Cox’s regression model. Hepatology. 7, 1346-1358 (1987).
- Barmada, S. J., et al. Autophagy induction enhances TDP43 turnover and survival in neuronal ALS models. Nature Chemical Biology. 10, 677-685 (2014).
- Barmada, S. J., et al. Amelioration of toxicity in neuronal models of amyotrophic lateral sclerosis by hUPF1. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 112, 7821-7826 (2015).
- Malik, A. M., et al. Matrin 3-dependent neurotoxicity is modified by nucleic acid binding and nucleocytoplasmic localization. Elife. 7, (2018).
- Archbold, H. C., et al. TDP43 nuclear export and neurodegeneration in models of amyotrophic lateral sclerosis and frontotemporal dementia. Scientific Reports. 8, 4606 (2018).
- Green, K. M., et al. RAN translation at C9orf72-associated repeat expansions is selectively enhanced by the integrated stress response. Nature Communications. 8, 2005 (2017).
- Park, S. -. K., et al. Overexpression of the essential Sis1 chaperone reduces TDP-43 effects on toxicity and proteolysis. PLOS Genetics. 13, e1006805 (2017).
- Gupta, R., et al. The Proline/Arginine Dipeptide from Hexanucleotide Repeat Expanded C9ORF72 Inhibits the Proteasome. eNeuro. 4, (2017).
- Angelov, B., Angelova, A. Nanoscale clustering of the neurotrophin receptor TrkB revealed by super-resolution STED microscopy. Nanoscale. 9 (28), 9797-9804 (2017).
