고체 및 혈액암 세포를 표적으로 하는 키메라 항원 수용체 T 세포를 위한 실시간 힘 분석

1. CAR 인코딩 렌티바이러스 의 생성 참고: 특정 CAR T 세포 플라스미드 시공이 완료되면(CD47 등), 렌티바이러스 CA는 293FT 세포, 렌티바이러스 패키징 믹스 및 형질전환제(재료표 참조)를 사용하여 표준 절차에 의해 생성된다(재료표참조). 이어서, 정량적 역전사 중합효소 연쇄 반응(RT-PCR) 키트 및 열 사이클러(재료 표참조)를 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 렌티바이러스 RNA 양을 측정하여 바이러스 역가를 결정한다. 모든 렌티 바이러스 절차는 안전 요구 사항을 엄격히 따르는 것이 중요합니다. 종자 15 x 106 HEK293FT 세포를 덜베코의 변형된 이글 배지(DMEM)에서 가습된 5%CO2 인큐베이터 내부에 150 mm 접시에 37°C에서 밤새 배양한다. 형질감염 복합체로 15 mL 튜브 2개를 준비합니다. 제1 튜브는 2.5 mL의 트랜스펙션 희석 액에서 렌티바이러스 벡터 플라스미드 DNA(5 μg) 및 렌티바이러스 패키징 믹스(22.5 μg)를 함유하고 있다. 두 번째 튜브는 2.5 mL의 형질감염 정제 액에 82.5 μL의 형질감염 시약을 함유하고 있습니다(재료 표참조). 튜브 1의 내용물 인 튜브 2를 피펫하고, 15 분 동안 실온에서 혼합물을 배양한다. 튜브의 내용물방울을 HEK293FT 세포의 접시에 전달하고 가습된 5%CO2 인큐베이터에서 37°C에서 밤새 샘플을 배양하였다. 다음날, 기존 배지를 신선한 DMEM 배양 배지의 19 mL로 대체하고 37°C에서 가습된 5%CO2 인큐베이터 내부에서 밤새 세포를 배양하는 것을 계속한다. 접시에서 50 mL 원심 분리튜브로 매체를 옮김을 옮김. 냉장고에 바이러스가 함유 된 매체로 튜브를 보관하십시오. 위의 절차를 반복하여 신선한 DMEM을 추가하고 1 일 후에 다시 수집하십시오. 하나의 원심 분리튜브에 미디어의 두 컬렉션을 결합합니다. 4 °C에서 30 분 동안 2,000 x g에서 튜브를 원심 분리합니다. 렌티바이러스함유 상층의 대부분을 초투명 원심분리관으로 옮니다. 세포 및/또는 파편을 포함할 수 있는 펠릿을 방해하지 않도록 상급물질의 최소 부피,약 1 mL를 남겨두십시오. 상기 초음파 원심분리기는 4°C에서 100분 동안 110,000 x g에서 상급을 명확히 하였다. 상급체를 조심스럽게 제거하고 튜브 바닥의 바이러스 펠릿에 DMEM 배지 100 μL을 부드럽게 추가합니다. 튜브를 얼음 위에 15분 동안 두십시오. 용액을 부드럽게 섞고 렌티바이러스 용액을 미리 냉장 멸균 튜브에 넣습니다. 이러한 바이러스 스톡 튜브를 -80°C 냉동실에 보관하십시오. 렌티바이러스 RNA를 추출하고 측정하는 제조업체의 프로토콜에 따라 정량적 RT-PCR 키트를 사용하여 렌티바이러스의 적규자를 결정합니다. 2. CAR T 세포의 생성 및 확장 이전에 냉동된 인간 PBMC(약 1 x 106 ~ 2 x 106 세포)를 동일한 수의 CD3/CD28 코팅 마이크로비드로 CAR T 세포 배지의 1mL에서 활성화하고 24시간 동안 가습된 5%CO2 인큐베이터에서 37°C에서 세포를 배양합니다. 얼음에 렌티 바이러스 주식의 알리쿼트해. 1 μL의 트랜스덕션 강화제를 세포와 함께 우물에 넣고 섞는다. 5:1의 감염(MOI)의 복합성에서 세포에 렌티바이러스를 추가하고 부드럽게 섞는다. 다음 날이 단계를 반복하십시오 (첫 번째 변환 후 24 시간). 2-3일마다 T 세포 성장을 모니터링한다. 1 x 10 6 ~ 2x 106 셀 /mL의 밀도로 세포를 유지하기 위해 신선한 CAR T 세포 배지를 더 추가하십시오. 동결 용액을 사용하여 표준 프로토콜로 CAR T 셀을 동결합니다(재료 표참조). 표준 방법을 사용하여 CAR T 세포를 해동하고 분석법에 적용하기 전에 IL-2 (300 단위/mL)로 약 2-4 시간 동안 CAR T 세포 배지에서 이를 배양합니다. 3. 유세포측정에 의한 CAR 발현 검출 3 x 105 CAR T 세포와 비트랜스듀싱 T 세포를 2개의 분리된 1.5 mL 마이크로원지 튜브로 옮김. 튜브를 300 x g에서 2분 동안 원심분리하고 1% 인간 혈청을 함유하는 형광 활성화 세포 선별(FACS) 완충액의 200 μL에서 세포를 재중단한다. 5 mL 폴리스티렌 FACS 튜브 2 개에 셀 용액의 파이펫 100 μL을 넣고 튜브를 얼음 위에 5 분 동안 유지하십시오. 각 세포 유형의 1 개의 튜브에 1 μL의 생체 생물 염소 항 마우스 F (ab’)를 추가합니다. 그런 다음, 각 세포 유형의 다른 튜브에 PE 표지 된 항 태그 항체 2 μL을 추가합니다 (재료 표참조). 잘 섞어서 30분 동안 얼음위에 배양합니다. 각 튜브에 FACS 버퍼의 3 mL로 세포를 세척하고 5 분 동안 300 x g에서 튜브를 원심 분리; 초자연적 인 와류를 매우 짧게 버리거나 튜브를 잠시 흔들어 잔류 액체의 세포를 다시 중단시하십시오. 각 튜브에 APC 항 CD3 2 μL과 7-AAD 항체 용액 2 μL을 추가합니다(재료 표참조). 안티 F (ab’)2 Ab로 염색 된 세포의 튜브에 PE 표지 된 스트렙타비딘 1 μL을 추가합니다. 잠깐 섞어서 30분 더 얼음에 튜브를 배양합니다. FACS 버퍼를 사용하여 단계 3.5에 설명된 대로 세포를 다시 세척하고 각 튜브에 FACS 버퍼의 200 μL을 추가합니다. 유세포 분석기를 사용하여 전방 산란 대 측면 산란 플롯에서 T 셀을 먼저 게이팅한 다음 CD3 대 7-AAD 플롯에서 라이브 셀(7-AAD-음성)을 게이팅하여 세포를 분석합니다. 마지막 단계는 안티 태그, 안티 ScFv 또는 안티 F (ab’)2 대 CD3를 분석하는 것입니다. 4. 실시간 세포용해 효능 분석 참고: 제조업체의 권장 조건에 따라 RTCA 분석 작업을 수행합니다. 간단히 말해서, 먼저 E-플레이트의 우물에서 표적 세포를 플레이트하고, 다음날 CAR T 세포를 첨가하였다. 표적 세포에 대한 CAR T 세포의 세포용해 활성은 실시간으로 모니터링된다. T 세포 및 모의 변환 T 세포 (모의 CAR T 세포)는 음성 이펙터 셀 컨트롤로 사용됩니다. 다음 프로토콜은 부착성 종양 세포전에 대한 시험관내 실시간 세포용해 효능 분석기를 기술한다. xCELLigence E-Plate의 각 웰에 표적 세포 배양 배지 100 μL을 추가하고, xCELLigence 계측기 내부에 플레이트를 놓고, 배경 판독을 합니다. 이어서, E-플레이트를 세포 파종을 위한 조직 배양 후드로 옮김을 전달한다. 표준 프로토콜을 사용하여 배양 장치에서 표적 암세포를 시도합니다. 그런 다음 세포를 15 mL 원심분리기로 옮기고 신선한 배양 배지를 최대 15 mL까지 추가합니다. 200 x g에서5 분 동안 원심 분리에 의해 세포를 펠렛. 상한자를 버리고 신선한 배지 5 mL를 추가하고 혈청 학적 파이펫을 사용하여 세포 펠렛을 부드럽게 다시 놓습니다. 혈세포계와 현미경을 사용하여 살아있는 세포의 밀도를 계산합니다. 세포 밀도를 적절히 조정한 다음 E-플레이트의 각 웰에 100 L의 셀 현탁액을 추가합니다. 표적 세포 수는 일반적으로 부착 세포주 (BxPC3, Hela-CD19 및 SKOV3)에 대한 약 10,000 개의 세포 / 웰 또는 Raji와 같은 현탁액 세포의 30,000 세포 / 웰 (액체 암 세포를 묶기 위해 항체가있는 사전 코팅 우물에 대한 자세한 내용은 아래 참조)입니다. 실온에서 E-Plate를 30분 동안 평형화하여 세포가 우물 바닥에 고르게 정착할 수 있도록 합니다(이것은 매우 중요하며 이 단계를 건너뛰지 마십시오). E-플레이트를 세포 배양 인큐베이터 내부의 xCELLigence 계측기에 넣고 임피던스를 측정하기 시작하여 세포 지수 대 시간으로 표시되며, 자동으로 15분마다 표시됩니다. 다음날, 이펙터 CAR T 세포를 준비한다. 모든 셀이 동시에 준비되었는지 확인하기 위해 적절한 컨트롤(예: Mock CAR T 셀, 비변환 제어 T 셀 및/또는 관련없는 CAR T 셀)을 미리 준비해야 합니다. 이펙터 셀과 대조군 셀을 적절한 밀도로 조정하고, 9단계에서 각각의 웰에 100 μL의 이펙터 셀 현탁액이 첨가될 때 원하는 E:T 비율이 달성될 수 있도록 직렬 희석을 준비한다. xCELLigence 데이터 수집을 일시 중지하고 인큐베이터로부터 세포 배양 후드로 E-플레이트를 가져온다. 각 우물에서 배지 100 μL을 제거합니다. 각 웰의 잔류 배지의 양은 이제 100 μL입니다. 100 μL의 직렬 희석 이펙터 CAR T 셀 또는 다른 제어 셀(즉, 모의 CAR T 셀)을 추가하여 원하는 E:T 비율을 달성합니다. 이펙터 세포가 침전될 수 있도록 실온에서 E-플레이트를 30분 동안 평형화한 다음 E-Plate를 다시 xCELLigence 계측기에 넣습니다. 데이터 수집을 다시 시작합니다. 이렇게 원하는 경우, 주요 시점에서 xCELLigence 데이터 수집은 직교 분석(즉, ELISA 또는 유세포측정에 의한 사이토카인 생산 측정)에 의해 분석되는 작은 샘플을 수집하기 위해 일시 중지되고 플레이트를 제거할 수 있다. EGFR-GITR-CD3 CAR T 세포 실험에서 ELISA 키트로 INFγ 수율을 측정합니다(제조업체의 지시에 따라; 재료 표참조).액체 암의 사용에 관하여 참고: 비 부착혈액암 세포를 시험하기 위하여, 세포를 추가하기 전에 E-Plate의 우물은 암세포의 표면에 표현되는 항원에 특정한 항체로 먼저 코팅됩니다. 라지 B 세포주의 경우 항 CD40에 기초한 테더링 시약이 사용된다(재료표에서액체 종양 살해 분석 키트 참조). 다음은 플레이트 코팅 절차입니다. 테더링 버퍼로 테더링 시약(안티-CD40)을 4 μg/mL의 농도로 희석합니다. 조직 배양 후드 내부에서 작업하여, 희석된 테더링 시약의 50 μL을 E-플레이트의 각 웰에 첨가한다. E-플레이트를 실온 또는 37°C 인큐베이터에 3시간 동안 둡니다. 테더링 시약을 제거하고 세척 버퍼로 E-Plate를 2x 이상 세척합니다. 이 시점에서, E-플레이트는 라지 표적 세포(30,000세포/웰)를 시드할 준비가 되어 있다. 4.1 단계 (위)를 계속하여 절차의 나머지 부분을 수행하십시오.